-HPLC gebaseerde test voor Monitor extracellulaire Nucleotide / Nucleoside Metabolism in Human Chronische Lymfatische Leukemie Cellen
Summary
The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.
Abstract
Deze methode beschrijft een gevoelige, specifieke, betrouwbare en reproduceerbare omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) assay ontwikkeld en gevalideerd voor de kwantificering van extracellulaire purine nucleotiden en nucleosiden door gezuiverde chronische lymfocytische leukemie (CLL) cellen onder verschillende kweekomstandigheden . De chromatografische scheiding van adenosine 5'-monofosfaat (AMP), adenosine (ADO) en inosine (INO) wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur op silicabasis, omgekeerde fasekolom die wordt gebruikt voor polaire verbinding vasthouden. De werkwijze omvat een binaire mobiele fase, bestaande uit 7 mM ammoniumacetaat en acetonitril met een stroomsnelheid van 1,00 ml / min. De eluaten worden geanalyseerd met een fotodiode array UV detector ingesteld op 260 nm. Een standaard kalibratiekromme wordt gegenereerd om de vergelijking te berekenen voor de analytische kwantificering van elke purine- verbinding. System control, data-acquisitie en analyse worden vervolgens uitgevoerd. Het toepassen van dit protocol, AMP, INO en ADO elueren op 7, 11 en 11,9 min, respectievelijk, en de totale looptijd voor elk monster is 20 min. Dit protocol kan worden toegepast op verschillende soorten cellen en cellijnen (zowel hechtende en suspensie), gebruikt als kweekmedia matrix. De voordelen zijn gemakkelijk en snel monstervoorbereiding en de eis van een geringe hoeveelheid supernatant voor analyse. Bovendien is het gebruik van een serumvrij medium laat overslaan van de eiwitten neerslaan met acetonitril dat invloed op de uiteindelijke concentratie van purineverbindingen. Een van de beperkingen van de methode is de eis van de verevening kolom lopen voor elke één monster run, waardoor de totale looptijd van het experiment langer en het voorkomen van high throughput screening toepassingen.
Introduction
Adenosine (ADO) is een purine nucleoside met een adenine molecule via een glycosidische binding gehecht aan een ribose suiker molecuul groep. Wanneer aanwezig in het extracellulaire milieu beschermt de cellen tegen overmatige beschadiging door de werking van het immuunsysteem. Deze rol is aangegeven door middel van verschillende ziektemodellen, zoals colitis 1, 2 diabetes, astma 3, 4 sepsis en ischemisch letsel 5. Een van de belangrijkste functies ADO de remming van immuunresponsen bij de tumor micro bijdragen aan tumor immune evasion 6. Daarom zijn de bij ADO vorming en signalering mechanismen van aanzienlijk therapeutisch belang 7.
ADO niveaus in het weefsel micro relatief laag onder normale fysiologische omstandigheden en zeker onder de drempel van immuuncellen. Echter, tijdens hypoxie, ischemie, ontsteking, infectie, metabolestress en tumor transformatie ze snel toenemen 8. De verhoogde ADO extracellulaire niveaus als reactie op weefsel storende signalen een dubbele functie: weefselschade melden op een autocriene en paracriene manier en weefselreacties die in het algemeen kan worden beschouwd als cytoprotectieve genereren.
Extracellulaire ADO kan worden gevormd door een verscheidenheid van mechanismen, die afgifte van intracellulaire compartimenten gemedieerd door nucleoside transporteurs 9 of accumulatie vanwege verminderde afbraak uitgevoerd door adenosine deaminase bevatten. De belangrijkste route leidend tot verhoogde extracellulaire ADO niveaus gaat de werking van een cascade van ectonucleotidases dat membraangeassocieerd ectoenzymes genereren ADO door phosphohydrolysis nucleotiden vrij van dode of stervende cellen. Deze route gaat via de opeenvolgende werking van CD39 (ectonucleoside trifosfaat diphosphohydrolase-1), die extracellulaire adenosine 5'-trifosfaat omgezet (ATP) of adenosine-5'-difosfaat (ADP) adenosine 5'-monofosfaat (AMP) en CD73 (5'-nucleotidase), die wordt omgezet AMP ADO 10.
Extracellulaire ADO lokt haar fysiologische reacties door te binden aan vier transmembraan ADO-receptoren, te weten A1, A2A, A2B en A3. Elke receptor heeft verschillende affiniteiten voor ADO en specifieke verdeling weefsel. Alle receptoren hebben zeven transmembraandomeinen en zijn G-proteïne gekoppelde intracellulaire GTP-bindende eiwitten (G-eiwitten), die kan induceren (Gs eiwit) of remmen (Gi-eiwit) adenylaatcyclase-activiteit en vervolgens de productie van intracellulair cAMP. Daarom veranderingen in cytoplasmatische cAMP effect op intracellulair proteïne kinase activiteit tijdens fysiologische reacties 11. Onder fysiologische omstandigheden extracellulaire ADO is dan 1 uM, die zonder onderscheid A1, A2A en A3 receptoren activeert. De activering van A2B subtype vereist aanzienlijk hogereconcentraties van het nucleoside, bijvoorbeeld ontstaan onder pathofysiologische omstandigheden. Alternatief kan extracellulaire ADO worden afgebroken tot inosine (INO) van adenosine deaminase (ADA) en CD26, een ADA complexerende eiwit lokaliseren ADA op het celoppervlak. Een andere mogelijkheid is dat ADO wordt geïnternaliseerd door de cel door de equilibrerende nucleoside transporters (KNO) en gefosforyleerd aan AMP door ADO kinase eiwit 12,13.
Het doel van dit protocol is een analytische werkwijze voor omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) beschrijven kwantificeren in een enkele run het substraat AMP en de producten ADO en INO, zoals gegenereerd door menselijke lymfocyten. Onze ervaring was oorspronkelijk verkregen met cellen van chronische lymfocytische leukemie (CLL) patiënten, die worden gekenmerkt door de expansie van een volwassen populatie van CD19 + / CD5 + B-lymfocyten constitutief CD39 14,15. We toonden ongeveer 30%van CLL drukken de CD73 ecto-enzym en dat dit fenotype correleert met een slechte prognose 16. Deze subpopulatie van leukemische cellen co-expressie CD39 en CD73 kunnen actief produceren extracellulaire ADO van ADP en / of AMP. Voorincubatie van CD73 + CLL cellen met α, β-methyleen-ADP (APCP), een bekende remmer van CD73 enzymatische activiteit blokkeert volledig extracellulaire ADO synthese bevestigd dat CD73 vertegenwoordigt het knelpunt enzym van deze cascade 16.
CLL cellen ook de expliciete ADA en het ADA complexerende eiwit CD26, die verantwoordelijk zijn voor de omzetting van ADO in INO zijn. ADA door specifieke remmers, zoals erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) I wiadenine (EHNa) hydrochloride en deoxycoformycine (dCF), is het mogelijk om ADO extracellulaire afbraak blok in INO. Bovendien voorbehandeling met een ADA-remmer in combinatie met dipyridamol, blokkeert nucleoside transporteurs, verbetert ADO accumulatie in celsupernatanten.
We hebben vervolgens uitgebreid dit protocol om cellen afkomstig van andere geslachten, waaronder T-lymfocyten en myeloïde cellen bevestigt CD73-afhankelijke ADO productie. Deze bevindingen suggereren dat dit HPLC protocol is zeer veelzijdig en kan worden toegepast op verschillende cellijnen en verschillende kweekomstandigheden (figuur 1).
Figuur 1. Schematische weergave van de enzymatische machinerie belast extracellulaire ADO productie. Adenosine 5'-trifosfaat (ATP) en / of adenosine 5'-difosfaat (ADP) kan worden afgebroken door CD39 adenosine 5'-monofosfaat (AMP), die op zijn beurt wordt omgezet door CD73 in de nucleoside adenosine (ADO). Zodra ADO wordt in de extracellulaire ruimte, kan de cel door de nucleoside transporteurs (ENT) opnieuw in te voeren, worden omgezet in inosine (INO) ofbinden aan verschillende types van P1 ADO receptoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocol mogelijk maakt de activiteit van de CD39 / CD73 adenosinergic machines in celkweekmedia van gezuiverde humane leukemiecellen evalueren. Via deze HPLC-methode kunnen we volgen en kwantitatief meten van de enzymatische generatie van ADO (CD73-afhankelijk is) en de daaropvolgende degradatie naar INO (CD26 / ADA afhankelijk). Het gebruik van enzymremmers maakt het protocol controle en interne controles. De voordelen en nieuwigheden van dit protocol is dat i) kan worden toegepast op cellen die gro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
Materials
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37 % |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
Referências
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
- Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
- Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
- Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
- Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
- Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
- Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
- Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M. Nucleoside transporter proteins. Curr Vasc Pharmacol. 7 (4), 426-434 (2009).
- Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
- Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
- Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
- Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what’s new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
- Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 352 (8), 804-815 (2005).
- Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
- Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
- Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
- Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).
