JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Química

Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen

Published: July 04, 2016
doi:
10.3791/54127
, ,
1Department of Physiology and Biophysics,Case Western Reserve University, 2School of Medicine,Case Western Reserve University

Summary

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Abstract

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

Introduction

In de afgelopen tien jaar is de structurele begrip van pentamere-Ionotrope receptor (pLGIC) gegroeid in sprongen en grenzen, als gevolg van massa's met een hoge resolutie structuren van een aantal leden van de familie. Belangrijke factoren die tot de huidige ontwikkelingen op het gebied omvatten de ontdekking van prokaryote pLGIC kanalen 1-3 belangrijke vooruitgang in eukaryote membraan eiwitexpressie 4-6 en enorme doorbraken in structuurbepaling benaderingen. 7 Deze structuren een duidelijke consensus de totale bescherming van de driedimensionale architectuur van pLGIC. Echter, twee belangrijke gebieden die lijken te achter parcours zijn de functionele karakterisering van deze kanaal voorbereidingen en de mechanistische beschrijving van het kanaal functie.

Gating conformationele veranderingen zijn complex en komen dus op 60 een afstand langs de lengte van het kanaal en deze overgangen worden uitgebreid gemoduleerd doormembraanlipiden. Met name negatieve lipiden, cholesterol en fosfolipiden blijkt de functie van pLGIC 8-11 moduleren. Hoewel de precieze rol van deze lipide bestanddelen in kanaal functie nog onbekend is, zou een volledige moleculaire begrip van gating vereist het bestuderen van deze kanalen in hun eigen omgeving. Site-Directed Spin Labeling (SDSL) en elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie zijn de technieken van de keuze voor het bestuderen van eiwit dynamiek in opgeloste systemen. EPR spectroscopie wordt niet beperkt door de molecuulgrootte (volgens NMR) of optische eigenschap van het monster (volgens fluorescentiespectroscopie), waardoor aldus metingen van volledige lengte constructen opgelost in lipide natieve omstandigheden. De techniek is zeer gevoelig en heeft een relatief lage eisen monster (in de pico-mol bereik). Beide aspecten maken de techniek zeer geschikt voor het bestuderen van grote membraaneiwitten die moeilijk in te drukken in milligramhoeveelheden.

Het gebruik van EPR spectroscopie gecombineerd met plaatsgerichte spin labeling werd ontwikkeld door Wayne Hubbell en collega's, en is aangepast voor het bestuderen van verschillende types eiwit. 12-24 EPR gegevens werden gebruikt om secundaire structuren te onderzoeken, veranderingen in het eiwit conformatie, membraan-insteekdieptes en eiwit-eiwit / eiwit-ligand interacties.

De werkwijze omvat cysteïne vervanging op posities plaats door plaatsgerichte mutagenese. Sitespecifieke labeling waarborgen, is het noodzakelijk om natieve cysteïnes te vervangen door een andere aminozuur (bijv. Serine) een cysteïne-less sjabloon. Verreweg de meest populaire spinlabel een thiol-specifieke MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate die hecht aan het eiwit via een disulfidebinding brug. Door de hoge specificiteit, relatief kleine omvang (iets groter dan tryptofaan) en flexibaarheid van het linkergebied, heeft deze spinlabel aangetoond uitstekende reactiviteit zelfs met een begraven cysteïne. Voorts tot de reactiviteit te maximaliseren, de markeringsreactie van het eiwit wordt uitgevoerd in de detergens gesolubiliseerde vorm uitgevoerd. Na afscheiding van de overmaat vrije spin-label door gelpermeatiechromatografie, wordt het eiwit opgelost in liposomen of bilaag nabootsen systemen gedefinieerde lipidesamenstelling. In het algemeen wordt cysteine ​​mutagenese goed verdragen in de meeste delen van het eiwit en de betrekkelijk geringe omvang van de spin-probe geeft vrijwel geen storing van de secundaire en tertiaire structuren. Opdat de modificatie vastgehouden wildtype functies kunnen het gemerkte en geregenereerde kanalen worden bestudeerd door de patch-clamp metingen.

Het gemerkte-functioneel eiwit wordt vervolgens onderworpen aan spectroscopische metingen, die in wezen bevatten drie hoofdtypen informatie: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-probe dynamica van lineshaap analyse; toegankelijkheid van de sonde te paramagnetische ontspanning agenten; en afstand distributie. 27 EPR afstanden worden gemeten door twee verschillende benaderingen. De eerste is gebaseerd op de Continuous Wave (CW) techniek, waarbij spectrale verbreding gevolg van dipolaire interacties tussen spin-labels (in de 8-20 Å afstandsbereik). Wordt gebruikt om de afstand te bepalen 28,29 De tweede is een gepulste EPR methode waar afstand metingen tot 70 Å. 30-34 kan worden verlengd in Double Electron Electron Resonance (herten), oscillaties in de spin-echo amplitude worden geanalyseerd om afstanden en de afstand distributies te bepalen. Hier de spin echo gemoduleerd op de frequentie van de dipool interactie. Samen worden deze parameters gebruikt om eiwit topologie, secundaire structurele elementen, en eiwit-conformationele veranderingen te bepalen.

Protocol

1. Site mutagenese en Cys Mutaties Klonering en mutagenese OPMERKING: GLIC wildtype (wt) 35 heeft een natieve cysteïne (C27), die is gemuteerd naar serine-cysteïne een minder achtergrond te maken. Cysteïne mutaties worden geïntroduceerd op de cysteïne-less achtergrond door plaatsgerichte mutagenese onder toepassing van primers die een cysteïne codon voeren op de gewenste positie 36. Meng 5 ui 10x reactiebuffer, 1 pi 100 ng / ul cysteine-loze GLIC matrijs DN…

Representative Results

Biochemische karakterisering van Spin gelabelde GLIC Mutants Na de hierboven beschreven protocol zou levert doorgaans GLIC MBP-fusie-eiwit in het traject van 10 – 12 mg / l cultuur. Hoewel deze waarde kan variëren in verschillende mutanten, in het bijzonder voor functies begraven in het eiwit, kan de opbrengst aanzienlijk worden aangetast. In deze gevallen kan het kweekmedium volumes vereisen schaalvergroting…

Discussion

EPR spectroscopie heeft zich bewezen als een ongeëvenaarde structurele aanpak in het kwantificeren van conformationele veranderingen in membraaneiwitten in een near-native omgeving. Deze aanpak stelt ons in staat een kijkje in de moleculaire details van eiwitten dynamiek die in hoge resolutie structuren worden verduisterd van X-ray kristallografie en Cryo-elektronenmicroscopie. Het is echter belangrijk om het technische beperkingen van deze benadering die de algemene toepasbaarheid beïnvloeden andere systemen en ook r…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn erg dankbaar voor de huidige en voormalige leden van de Chakrapani lab voor kritisch lezen en opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie ​​(1R01GM108921) en de American Heart Association (NCRP Wetenschapper Development Grant 12SDG12070069) en SC.

Materials

Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
KH2PO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.Coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4 (2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452 (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457 (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474 (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512 (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512 (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. , (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Bioquímica. 25 (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284 (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259 (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23 (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27 (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7 (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19 (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102 (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Bioquímica. 52 (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4 (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248 (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Bioquímica. 35 (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56 (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89 (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Bioquímica. 40 (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124 (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172 (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9 (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86 (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457 (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287 (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Bioquímica. 38 (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Bioquímica. 38 (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16 (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88 (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285 (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321 (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Bioquímica. 47 (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158 (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5 (10), e271 (2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98 (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142 (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30 (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289 (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11 (11), e1001714 (2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288 (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23 (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Bioquímica. 46 (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281 (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Bioquímica. 51 (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (39), 9108-9111 (2011).

Tags

Keywords: Site Directed Spin LabelingEPR SpectroscopyPentameric Ligand-gated Ion ChannelsMembrane Protein DynamicsGLICSite-directed MutagenesisProtein PurificationCell LysisMembrane Protein Reconstitution
check_url/pt/54127?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image