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Química

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Published: July 04, 2016
doi:
10.3791/54127
, ,
1Department of Physiology and Biophysics,Case Western Reserve University, 2School of Medicine,Case Western Reserve University

Summary

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Abstract

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

Introduction

durch Scharen von hochaufgelösten Strukturen von mehreren Mitgliedern der Familie im Laufe der letzten zehn Jahre, das strukturelle Verständnis von pentamerem ligandengesteuerten Ionenkanäle (pLGIC) hat sprunghaft gewachsen. Wichtige Faktoren, die zu den aktuellen Entwicklungen auf dem Gebiet geführt sind, die Entdeckung von prokaryotischen pLGIC Kanäle, 1-3 großen Fortschritte in der Expression eukaryotischen Membranprotein, 4-6 und enorme Durchbrüche in der Strukturbestimmung Ansätze. 7 Diese Strukturen auf einen klaren Konsens schaffen die Gesamt Erhaltung der dreidimensionalen Architektur pLGIC. Allerdings sind zwei wichtige Bereiche, die sich hinter nachlaufen scheinen, sind die funktionelle Charakterisierung dieser Kanal Vorbereitungen und die mechanistische Beschreibung der Kanalfunktion.

Gating Konformationsänderungen sind komplex und treten über eine 60 Å Abstand entlang der Länge des Kanals und diese Übergänge werden in großem Umfang moduliert durchMembranlipiden. Insbesondere negativen Lipiden, Cholesterin und Phospholipide wurden , um die Funktion der pLGIC 8-11 zu modulieren gezeigt. Während die genaue Rolle dieser Lipidbestand in Kanalfunktion unbekannt bleibt, würde eine vollständige molekulare Verständnis der Gating diese Kanäle in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren. Site-ESR-Spektroskopie (SDSL) und Elektronenspinresonanz (EPR) -Spektroskopie sind die Techniken der Wahl für die Proteindynamik in rekonstituierten Systemen zu studieren. EPR-Spektroskopie wird durch die Molekülgröße (wie NMR) oder die optische Eigenschaft der Probe (wie Fluoreszenzspektroskopie) und dadurch ermöglicht Messungen von Volllängen-Konstrukten rekonstituiert in nativen Lipid Bedingungen beschränkt. Die Technik ist extrem empfindlich und relativ geringen Probenanforderungen (im pico-Mol-Bereich). Beide Aspekte machen die Technik gut geeignet für die Untersuchung großer Membranproteine, die schwer über Milligramm auszudrücken inMengen.

Die Verwendung von EPR – Spektroskopie in Kombination mit ortsgerichtete Spinmarkierung wurde von Wayne Hubbell und Kollegen entwickelt und wurde für die Untersuchung einer Reihe von Proteinarten angepasst. 12-24 EPR – Daten verwendet wurden , Sekundärstrukturen, Veränderungen in dem Protein zu untersuchen , Konformation, membran Einstecktiefen und Protein-Protein / Protein-Ligand-Wechselwirkungen.

Das Verfahren beinhaltet das an den Positionen von Interesse durch ortsgerichtete Mutagenese Cystein-Substitution. Um die ortsspezifische Markierung zu gewährleisten, ist es notwendig , nativen Cysteinen mit einer anderen Aminosäure zu ersetzen (z. B. Serin) ein Cystein-weniger Vorlage zu erstellen. Bei weitem ist die beliebteste Spin-Label eine Thiol-spezifische MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-Tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl) Methanthiosulfonat, die durch eine Disulfidbrücke Brücke an das Protein misst. Aufgrund seiner hohen Spezifität, relativ geringe Größe (etwas größer als Tryptophan) und flexikeit des Linkers Region hat sich diese Spin-Label mit einer vergrabenen Cystein sogar ausgezeichnete Reaktivität haben gezeigt worden. Weiterhin Reaktivität zu maximieren, die Markierungsreaktion des Proteins in Detergens-solubilisierten Form. Nach der Abtrennung des überschüssigen Chromatographie Gratis-Spin-Label durch Größenausschluss wird das Protein in Liposomen oder Doppelschicht-ähnlichen Systeme von definierten Lipidzusammensetzung rekonstituiert. Im allgemeinen wird Cystein Mutagenese auch in den meisten Teilen des Proteins toleriert, und die verhältnismäßig geringe Größe der Spin-Sonde verursacht minimale Störung der Sekundär- und Tertiärstrukturen. Um sicherzustellen, dass die Modifikation Wildtyp Funktionen beibehalten, die markierten und rekonstituiert Kanäle können durch Patch-Clamp-Messungen untersucht werden.

Das markierte funktionellen Protein wird dann zu spektroskopischen Messungen unterzogen, die drei Arten von Informationen im Wesentlichen liefern: 12,14,15,20,22,23,25-27 Spinsondendynamik durch lineshAffe Analyse; Zugänglichkeit der Sonde an paramagnetischem Entspannungsmittel; und Abstandsverteilung. 27 EPR Abstände werden durch zwei verschiedene Methoden gemessen. Die erste basiert auf dem Continuous Wave (CW) Technik, bei der spektrale Verbreiterung von dipolaren Wechselwirkungen zwischen Spin-Labels (in der von 8 – 20 Å Entfernungsbereich) entstehen. Verwendet wird Entfernung zu bestimmen 28,29 Die zweite ist eine gepulste EPR Verfahren , bei dem Abstandsmessungen bis 70 Å verlängert werden kann. 30-34 im Doppel Electron Electron Resonanz (DEER), Schwingungen in der Spin-Echo – Amplitude analysiert Abstände und Abstandsverteilungen zu bestimmen. Hier wird das Spin-Echo bei der Frequenz der dipolaren Wechselwirkung moduliert. Gemeinsam werden diese Parameter verwendet, um Protein-Topologie, Sekundärstrukturelemente und Protein-Konformationsänderungen zu bestimmen.

Protocol

1. zielgerichtete Mutagenese und Cys Mutations Klonierung und Mutagenese HINWEIS: GLIC Wildtyp (wt) 35 hat eine einzige native Cystein (C27), die zu Serin mutiert ist ein Cystein-weniger Hintergrund zu erstellen. Cystein- Mutationen werden auf der Cystein-less Hintergrund durch ortsgerichtete Mutagenese eingeführt , unter Verwendung von Primern , die ein Cystein – Kodon an der gewünschten Position 36 tragen. Mischungs 5 ul 10x Reaktionspuffer, 1 ul 100 ng / &am…

Representative Results

Biochemische Charakterisierung von Spin-markierten GLIC Mutants Nach dem oben beschriebenen Protokoll würde typischerweise GLIC-MBP-Fusionsprotein in dem Bereich von 10 ergeben – 12 mg / l Kultur. Obwohl dieser Wert in den verschiedenen Mutanten unterscheiden können, besonders für innerhalb des Proteins verborgen Positionen kann die Ausbeute erheblich beeinträchtigt werden. In diesen Fällen kann es erford…

Discussion

EPR-Spektroskopie hat sich als beispiellos strukturellen Ansatz zu sein, bei der Quantifizierung von Konformationsänderungen in Membranproteinen in einer nahezu nativen Umgebung. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, einen Blick in die molekularen Details der Proteindynamik, die in der hochauflösenden Strukturen von Röntgenkristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie verdeckt sind. Allerdings ist es wichtig, die technischen Grenzen dieses Ansatzes zu berücksichtigen, die die allgemeine Anwendbarkeit auf andere System…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind sehr dankbar, dass die aktuellen und ehemaligen Mitglieder des Chakrapani Labor für das kritische Lesen und Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant (1R01GM108921) und der American Heart Association (NCRP Scientist Entwicklungszuschuss 12SDG12070069) und SC unterstützt.

Materials

Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
KH2PO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.Coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622
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Referências

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Keywords: Site Directed Spin LabelingEPR SpectroscopyPentameric Ligand-gated Ion ChannelsMembrane Protein DynamicsGLICSite-directed MutagenesisProtein PurificationCell LysisMembrane Protein Reconstitution
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Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).
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