साइट निर्देशित स्पिन लेबल और Pentameric ligand-gated आयन चैनलों के EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन
Summary
This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.
Abstract
Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.
Introduction
पिछले दशक के दौरान, pentameric ligand-गेटेड आयन चैनल के संरचनात्मक समझ (pLGIC) कई गुना में वृद्धि हुई है, परिवार के कई सदस्यों के उच्च संकल्प संरचनाओं की भीड़ के कारण। महत्वपूर्ण कारक है कि क्षेत्र में वर्तमान प्रगति के लिए नेतृत्व संरचना निर्धारण दृष्टिकोण में prokaryotic pLGIC चैनलों की खोज, यूकेरियोटिक झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति में 1-3 प्रमुख प्रगति, 4-6 और जबरदस्त सफलताओं शामिल हैं। 7 इन संरचनाओं पर एक स्पष्ट आम सहमति प्रदान करते हैं pLGIC के तीन आयामी वास्तुकला के समग्र संरक्षण। हालांकि, दो प्रमुख क्षेत्रों है कि पीछे निशान लग रहे हो इन चैनल की तैयारियों के कार्यात्मक विशेषताओं और चैनल समारोह के यंत्रवत वर्णन कर रहे हैं।
Gating गठनात्मक परिवर्तन जटिल हैं और चैनल की लंबाई के साथ एक 60 दूरी पर पाए जाते हैं और ये बदलाव बड़े पैमाने पर कर रहे हैं द्वारा संग्राहकझिल्ली लिपिड। विशेष रूप से, नकारात्मक लिपिड, कोलेस्ट्रॉल, और फॉस्फोलिपिड pLGIC 8-11 के समारोह मिलाना दिखाया गया है। चैनल समारोह में इन लिपिड घटक की सटीक भूमिका अनजान बनी हुई है, वहीं gating की एक पूरी समझ आणविक उनके पैतृक वातावरण में इन चैनलों का अध्ययन करने की आवश्यकता होगी। साइट निर्देशित स्पिन लेबलिंग (SDSL) और इलेक्ट्रॉन समचुंबक अनुनाद (EPR) स्पेक्ट्रोस्कोपी का पुनर्गठन प्रणालियों में प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए पसंद की तकनीक है। EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी आणविक आकार के द्वारा सीमित नहीं है (एनएमआर है के रूप में) या नमूना के ऑप्टिकल संपत्ति (के रूप में प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी है), और इस तरह के मूल निवासी लिपिड की स्थिति में पुनर्गठन पूर्ण लंबाई निर्माणों की माप की अनुमति देता है। तकनीक बेहद संवेदनशील है और अपेक्षाकृत कम नमूना आवश्यकताओं (पिको-तिल रेंज में) है। इन दोनों पहलुओं मिलीग्राम ओवर में व्यक्त करने के लिए बड़ी झिल्ली प्रोटीन है कि मुश्किल हो जाता है के अध्ययन के लिए तकनीक अच्छी तरह से अनुकूल बनानामात्रा।
साइट निर्देशित स्पिन लेबलिंग के साथ संयोजन में EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग वेन Hubbell और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किया गया था, और प्रोटीन प्रकार की एक सीमा के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया गया है। 12-24 EPR डेटा माध्यमिक संरचनाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, प्रोटीन में परिवर्तन रचना, झिल्ली प्रविष्टि गहराई, और प्रोटीन, प्रोटीन / प्रोटीन ligand बातचीत।
विधि साइट निर्देशित mutagenesis द्वारा ब्याज की स्थिति में सिस्टीन प्रतिस्थापन शामिल है। साइट विशेष लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए यह एक और एमिनो एसिड के साथ (जैसे।, सेरीन) देशी cysteines स्थानापन्न करने के लिए एक सिस्टीन-कम टेम्पलेट बनाने के लिए आवश्यक है। (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-मिथाइल) methanethiosulfonate कि एक डाइसल्फ़ाइड बंधन पुल के माध्यम से प्रोटीन के लिए देता है: अब तक, सबसे लोकप्रिय स्पिन लेबल एक thiol-विशिष्ट MTSL है। इसकी उच्च विशिष्टता, अपेक्षाकृत छोटे आकार (नियासिन तुलना में थोड़ा बड़ा है), और फ्लेक्सी के कारणलिंकर क्षेत्र की साख, इस स्पिन लेबल भी एक दफन सिस्टीन के साथ उत्कृष्ट जेट के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, जेट अधिकतम करने के लिए, प्रोटीन की लेबलिंग प्रतिक्रिया बाहर डिटर्जेंट solubilized रूप में किया जाता है। अतिरिक्त मुक्त स्पिन लेबल आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा की जुदाई के बाद, प्रोटीन liposomes या परिभाषित लिपिड रचना की bilayer नकल उतार सिस्टम में पुनर्गठित किया गया है। सामान्य तौर पर, सिस्टीन म्युटाजेनेसिस अच्छी तरह से प्रोटीन के अधिकांश भागों में सहन किया है, और स्पिन जांच के अपेक्षाकृत छोटे आकार द्वितीयक और तृतीयक संरचनाओं के लिए कम से कम गड़बड़ी का कारण बनता है। यह सुनिश्चित करें कि संशोधन जंगली प्रकार के कार्यों को बनाए रखा, लेबल और पुनर्गठन चैनलों पैच दबाना माप द्वारा अध्ययन किया जा सकता है।
लेबल कार्यात्मक प्रोटीन तो स्पेक्ट्रोस्कोपी माप, जो अनिवार्य रूप से जानकारी के तीन मुख्य प्रकार प्रदान करने के अधीन है: linesh द्वारा 12,14,15,20,22,23,25-27 स्पिन जांच गतिशीलताबंदर विश्लेषण; समचुंबक छूट एजेंटों के लिए जांच की पहुंच; और दूरी वितरण। 27 EPR दूरी दो अलग अलग दृष्टिकोण से मापा जाता है। पहली निरंतर तरंग (सीडब्ल्यू) तकनीक है, जहां वर्णक्रम विस्तार स्पिन लेबल के बीच dipolar बातचीत से उत्पन्न होने वाली (8 में – 20 एक दूरी रेंज) पर आधारित है। दूरी तय करने के लिए प्रयोग किया जाता है 28,29 दूसरा एक स्पंदित EPR है विधि जहां दूरी माप 70। 30-34 तक बढ़ाया जा सकता है डबल इलेक्ट्रॉन इलेक्ट्रॉन अनुनाद (हिरण) में, स्पिन गूंज आयाम में दोलनों दूरी और दूरी वितरण निर्धारित करने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। यहाँ स्पिन गूंज dipolar बातचीत की आवृत्ति पर संग्राहक है। साथ में, इन मानकों प्रोटीन टोपोलॉजी, माध्यमिक संरचनात्मक तत्वों, और प्रोटीन गठनात्मक परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी एक के पास देशी वातावरण में झिल्ली प्रोटीन में गठनात्मक परिवर्तन बढ़ाता में एक अद्वितीय संरचनात्मक दृष्टिकोण साबित हो गया है। यह दृष्टिकोण हमें लगता है कि एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम महत्वपूर्ण पढ़ने और पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए चक्रपाणि प्रयोगशाला के वर्तमान और पूर्व सदस्यों के लिए बहुत आभारी हैं। इस काम के स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान (1R01GM108921) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (NCRP वैज्ञानिक विकास अनुदान 12SDG12070069) और अनुसूचित जाति के लिए समर्थन किया था।
Materials
| Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations | |||
| 10x PfuUltra HF reaction buffer | Agilent Technologies | 600380-52 | |
| dNTPS | New England BioLabs Inc | N0447L | 10mM each dNTP |
| pfu Ultra DNA polymerase | Agilent Technologies | 600380-51 | 2.5 U/ul |
| DPNI | New England BioLabs Inc | R0176S | 20,000 U/ml |
| XL10 GOLD | Agilent Technologies | 200314 | |
| SOC media | New England BioLabs Inc | B9020S | |
| Kanamycin | Fisher Scientfic | BP905 | |
| LB media | Invitrogen | 127957084 | |
| Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
| C43 competent cells | Lucigen | 60446 | |
| Expression and Purification | |||
| Glucose | Fisher Scientfic | D16 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421-500 | |
| Yeast extract | Amresco | J850 | |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229 | |
| K2HPO4 | Amresco | 0705 | |
| KH2PO4 | Amresco | 0781 | |
| IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) | Gold Biotechnology | I2481C25 | |
| Trizma Base | Sigma Life Science | T1503 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| DNase I | Sigma Life Science | DN25 | |
| PMSF | Amresco | M145 | |
| Leupeptine | Amresco | J580 | |
| Pepstatin | Amresco | J583 | |
| DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
| Amylose resin | New England BioLabs Inc | E8021L | |
| TCEP | Amresco | K831 | |
| EDTA | Fisher Scientfic | BP118 | |
| Maltose | Acros Organics | 329915000 | |
| Superdex 200GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
| Empty polypropylene Chromatography column | BioRad | 731-1550 | |
| Site-Directed Spin Labeling | |||
| MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | O873900 | |
| (1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | A167900 | |
| DMSO | J.T. Baker | 9224-01 | |
| Reconstitution | |||
| Asolectin lipid | Avanti polar lipids Inc | 541602C | |
| Biobeads (Polystyrine beads) | Bio Rad | 152-3920 | |
| Methanol | Fisher chemicals | A413 | |
| FRET | |||
| Fluorescein-maleimide | ThermoFisher Scientific | F-150 | |
| Tetramethylrhodamine-maleimide | ThermoFisher Scientific | T-6027 | |
| POPC | Avanti polar lipids Inc | 850457C | |
| POPG | Avanti polar lipids Inc | 840457C | |
| E.Coli polar lipid extract | Avanti polar lipids Inc | 100600C | |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | |
| EPR measurement | |||
| TPX plastic capillaries | Bruker | ER221 | |
| EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) | Aldrich | 158186 | |
| Ni(OH)2 | Aldrich | 283622 |
Referências
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