Sitio Dirigida Etiquetado vuelta y EPR estudios espectroscópicos de Canales pentamérica por ligando de iones
Summary
This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.
Abstract
Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.
Introduction
Durante la última década, la comprensión estructural de canales iónicos activados por ligando pentaméricas (pLGIC) ha crecido a pasos agigantados, debido a la multitud de estructuras de alta resolución de varios miembros de la familia. Los factores clave que llevaron a los avances actuales en el campo incluyen el descubrimiento de canales pLGIC procariotas, 1-3 grandes progresos en la expresión de proteínas de membrana eucariota, 4-6 y tremendos avances en los métodos de determinación de la estructura. 7 Estas estructuras proporcionan un consenso claro sobre la conservación general de la arquitectura tridimensional de pLGIC. Sin embargo, dos áreas principales que parecen zaga son la caracterización funcional de estas preparaciones de canal y la descripción mecanicista de la función de los canales.
Gating cambios conformacionales son complejas y se producen sobre una distancia 60 Å a lo largo de la longitud del canal y estas transiciones son ampliamente modulados porlípidos de membrana. En particular, los lípidos negativos, colesterol y fosfolípidos han sido demostrado que modulan la función de pLGIC 8-11. Mientras que el papel preciso de estos componentes de lípidos en la función del canal sigue siendo desconocida, una comprensión molecular completa de gating requeriría el estudio de estos canales en su ambiente nativo. Girar dirigida al sitio de etiquetar (SDSL) y la resonancia paramagnética de electrones (EPR) espectroscopia son las técnicas de elección para el estudio de la dinámica de proteínas en sistemas reconstituidos. espectroscopia EPR no está limitado por el tamaño molecular (como es NMR) o la propiedad óptica de la muestra (como es la espectroscopia de fluorescencia), y de ese modo permite mediciones de construcciones de longitud completa reconstituidas en condiciones de lípidos nativos. La técnica es extremadamente sensible y tiene requisitos relativamente bajos de la muestra (en el rango pico-moles). Estos dos aspectos hacen la técnica muy adecuada para el estudio de grandes proteínas de membrana que son difíciles de expresar en más de miligramocantidades.
El uso de la espectroscopia EPR en combinación con el etiquetado de giro dirigida al sitio fue desarrollado por Wayne Hubbell y sus colegas, y ha sido adaptado para el estudio de una variedad de tipos de proteínas. 12-24 de datos de EPR se han utilizado para investigar estructuras secundarias, los cambios en la proteína conformación, profundidades de inserción de membrana y proteína-proteína / interacciones proteína-ligando.
El método consiste en la sustitución de cisteína en las posiciones de interés mediante mutagénesis dirigida al sitio. Para garantizar el etiquetado específico del sitio, es necesario sustituir cisteínas nativas con otro aminoácido (por ejemplo., Serina) para crear una plantilla de cisteína menos. Por el momento, el marcador de espín más popular es un MTSL específico de tiol: (1-oxi-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) methanethiosulfonate que se une a la proteína a través de un puente de enlace disulfuro. Debido a su alta especificidad, tamaño relativamente pequeño (un poco más grande que el triptófano), y flexibilidad de la región de engarce, este marcador de espín se ha demostrado que tienen una excelente reactividad incluso con una cisteína enterrado. Además, para maximizar la reactividad, la reacción de marcaje de la proteína se lleva a cabo en forma solubilizada con detergente. Después de la separación del exceso de giro libre etiqueta por cromatografía de exclusión molecular, la proteína es reconstituido en liposomas o sistemas bicapa lipídica imitando de composición definida. En general, la mutagénesis cisteína es bien tolerado en la mayoría de las partes de la proteína, y el tamaño relativamente pequeño de la escisión de la sonda provoca perturbación mínima a las estructuras secundaria y terciaria. Para asegurarse de que la modificación conserva funciones de tipo salvaje, los canales marcados y reconstituidos se pueden estudiar por medio de mediciones de patch-clamp.
La proteína marcada con funcional se somete a continuación a mediciones espectroscópicas, que esencialmente proporcionan tres tipos principales de información: 12,14,15,20,22,23,25-27 dinámica spin-sonda por lineshanálisis de los simios; accesibilidad de la sonda con agentes de relajación paramagnéticas; y distribución a distancia. 27 distancias EPR se miden por dos enfoques diferentes. La primera se basa en la técnica de onda continua (CW), donde ensanchamiento espectral que surge de las interacciones dipolares entre spin-etiquetas (en el 8 – Rango de distancia a 20). Se utiliza para determinar la distancia 28,29 El segundo es un pulsada-EPR método en el que las mediciones de distancia pueden extenderse hasta 70 Å. 30-34 en doble Electron Electron Resonancia (ciervo), se analizan las oscilaciones de la amplitud de espín-eco para determinar las distancias y las distribuciones de distancia. Aquí el eco de espín se modula a la frecuencia de la interacción dipolar. Juntos, estos parámetros se utilizan para determinar la topología de proteínas, elementos estructurales secundarios, y los cambios conformacionales en proteínas.
Protocol
Representative Results
Discussion
espectroscopia EPR ha demostrado ser un enfoque estructural sin precedentes en la cuantificación de los cambios conformacionales en proteínas de la membrana en un entorno casi nativo. Este enfoque nos permite un vistazo a los detalles moleculares de la dinámica de proteínas que están ocultas en alta resolución de estructuras de cristalografía de rayos X y la crio-microscopía electrónica. Sin embargo, es importante tener en cuenta las limitaciones técnicas de este enfoque que puede afectar a la aplicabilidad ge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Chakrapani para la lectura crítica y los comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención (1R01GM108921) y la Asociación Americana del Corazón (NCRP Desarrollo Científico de Grant 12SDG12070069) y Carolina del Sur.
Materials
| Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations | |||
| 10x PfuUltra HF reaction buffer | Agilent Technologies | 600380-52 | |
| dNTPS | New England BioLabs Inc | N0447L | 10mM each dNTP |
| pfu Ultra DNA polymerase | Agilent Technologies | 600380-51 | 2.5 U/ul |
| DPNI | New England BioLabs Inc | R0176S | 20,000 U/ml |
| XL10 GOLD | Agilent Technologies | 200314 | |
| SOC media | New England BioLabs Inc | B9020S | |
| Kanamycin | Fisher Scientfic | BP905 | |
| LB media | Invitrogen | 127957084 | |
| Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
| C43 competent cells | Lucigen | 60446 | |
| Expression and Purification | |||
| Glucose | Fisher Scientfic | D16 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421-500 | |
| Yeast extract | Amresco | J850 | |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229 | |
| K2HPO4 | Amresco | 0705 | |
| KH2PO4 | Amresco | 0781 | |
| IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) | Gold Biotechnology | I2481C25 | |
| Trizma Base | Sigma Life Science | T1503 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| DNase I | Sigma Life Science | DN25 | |
| PMSF | Amresco | M145 | |
| Leupeptine | Amresco | J580 | |
| Pepstatin | Amresco | J583 | |
| DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
| Amylose resin | New England BioLabs Inc | E8021L | |
| TCEP | Amresco | K831 | |
| EDTA | Fisher Scientfic | BP118 | |
| Maltose | Acros Organics | 329915000 | |
| Superdex 200GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
| Empty polypropylene Chromatography column | BioRad | 731-1550 | |
| Site-Directed Spin Labeling | |||
| MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | O873900 | |
| (1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | A167900 | |
| DMSO | J.T. Baker | 9224-01 | |
| Reconstitution | |||
| Asolectin lipid | Avanti polar lipids Inc | 541602C | |
| Biobeads (Polystyrine beads) | Bio Rad | 152-3920 | |
| Methanol | Fisher chemicals | A413 | |
| FRET | |||
| Fluorescein-maleimide | ThermoFisher Scientific | F-150 | |
| Tetramethylrhodamine-maleimide | ThermoFisher Scientific | T-6027 | |
| POPC | Avanti polar lipids Inc | 850457C | |
| POPG | Avanti polar lipids Inc | 840457C | |
| E.Coli polar lipid extract | Avanti polar lipids Inc | 100600C | |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | |
| EPR measurement | |||
| TPX plastic capillaries | Bruker | ER221 | |
| EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) | Aldrich | 158186 | |
| Ni(OH)2 | Aldrich | 283622 |
Referências
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