ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化
Summary
We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.
Abstract
Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3′ hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).
Introduction
ガラスまたはビーズ表面に係留大きなDNA分子の可視化DNA基質、1,2および高分子物理学上のDNAタンパク質相互作用、タンパク質の動力学を調査するために利用されてきた。3,4-単一係留大型DNA分子のためのプラットフォームは、いくつかの異なるを有します他のDNA固定化方法に比べて利点が5まず、表面につなが大きいDNA分子は、その結合部位を認識するDNA結合タンパク質のための非常に重要であるせん断流れずに自然なランダムコイルコンフォメーションを有します。第二に、フローチャンバー内の一連の酵素反応のためのDNA分子の周りの化学的環境を変更することは非常に簡単です。第三に、マイクロ流体せん断流がDNA分子、このような表面固定化6及びナノチャネルの狭窄などの代替的なDNA伸長手法を用いて達成することは非常に困難である完全な輪郭の長さの100％にまで延伸を誘発する。7 A完全stretcheDのDNA分子は、ゲノムマップ上の酵素の動きを監視するために有用であることができる位置情報を提供します。
それにもかかわらず、DNAテザリングアプローチは、YOYO-1のような挿入色素は、一般的に容易に蛍光励起光によって破壊される係留DNA分子を引き起こすという重大な欠点を有しています。一般的に、大規模なDNA分子は蛍光顕微鏡下で可視化のための蛍光色素で染色されなければなりません。これらの色素は、それらが二本鎖DNAにインターカレートしたときにのみ蛍光を発するので、この目的のために、YOYO-1または他のTOTO系色素が主に使用されている。8しかし、ビス-インターカレート色素があるため、光誘導されるDNA光切断を引き起こすことがよく知られています蛍光体のインターカレーション。9更に、表面につなが蛍光染色されたDNA分子は、剪断流れが自由にDNA分子の移動の力を壊す発揮することができるため、より脆弱です。したがって、我々は新たなDとFP-DBPを開発しました表面に係留大型DNA分子を画像化するためのNA-染色タンパク質色素。 FP-DBPを使用する利点は、それが結合するDNA分子の光開裂を起こさないことである。加えて、10のビス-インターカレート色素は輪郭長さを増加しながら、FP-DBPは、DNAの輪郭の長さを増加させません約33％です。
このビデオ方式は、PEG-ビオチン表面に大きなDNA分子を係留するための実験的アプローチを紹介する。 図1は、平滑末端および付着末端を有するDNAを係留の異なるアプローチを示しています。したがって、この染色方法は、DNA分子の任意のタイプに適用することができる。 図2は、DNA分子を伸長するだけでなく、化学的および酵素をロードするためにせん断流を生成するために、シリンジポンプによって制御することができるフローチャンバアセンブリの概略図を示していますソリューション。 図3は、PEGylatにつなが完全に伸張したDNA分子の顕微鏡写真を示していますエド面11とFP-DBPで染色しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、表面上に固定するためにビオチン化長いDNA分子を可視化するためのプラットフォームを提示します。私たちは、ビオチン化ウシ血清アルブミンとアビジンタンパク質コーティングされた表面上の係留DNA分子のためのアプローチを報告している。6以前のアプローチでは、我々は上の係留DNA分子を染色ビス-インターカレーション染料によって引き起こされるDNAの光開裂の重要…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.
Materials
| 1. DNA Biotinylation | |||
| 1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
| Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
| T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
| Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
| 2. Functionalized Surface Derivatization | |||
| 2.1) Piranha Cleaning | |||
| Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22×22 mm, No. 1 Thickness |
| Teflon rack | Custom Fabrication | ||
| PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
| Sulferic acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95 % Purity |
| Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35 % in water |
| Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
| 2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
| N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99 % Purity |
| Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9 % Purity |
| Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
| Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9 % Purity |
| 2.3) PEGylation of the coverslip | |||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe Filter | Sartorius | 16534———-K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99 % Purity |
| Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76x26x1 mm |
| 3. Assembling a Flow Chamber | |||
| Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
| Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
| Quick-dry Epoxy | 3M | ||
| Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
| Microscope | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
| Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. | ||
Referências
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