فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات
Summary
يوفر هذا الاختبار تدفق التصاق بسيط، نموذج تأثير ارتفاع تي التفاعلات خلية الخلايا الظهارية. ويستخدم ضخ حقنة لتوليد إجهاد القص، ومتحد البؤر المجهر يلتقط الصور لتقدير. والهدف من هذه الدراسات هو تحديد فعالية الخلايا التائية التصاق باستخدام ظروف التدفق.
Abstract
وعموما، التصاق الخلايا التائية هو عنصر حاسم من وظيفة، والمساهمة في عمليات متميزة من تجنيد الخلايا إلى مواضع الالتهابات والتفاعل مع خلايا مقدمة للمستضد (APC) في تشكيل نقاط الاشتباك العصبي المناعية. هذه السياقات اثنين من الخلايا التائية التصاق تختلف في أن تي التفاعلات خلية APC يمكن اعتبار ثابت، في حين تحدى التفاعلات سفينة تي خلية الدم عن طريق إجهاد القص الناتجة عن التداول نفسها. تصنف التفاعلات تي خلية APC ك ثابتة في هذا الشريكين الخلوية والثابتة بالنسبة لبعضها البعض. عادة ما يحدث هذا التفاعل داخل الغدد الليمفاوية. كما تفاعل الخلايا التائية مع جدار الأوعية الدموية، والخلايا تعتقل ويجب أن تقاوم إجهاد القص ولدت 1،2 هذه الخلافات تبرز الحاجة إلى فهم أفضل التصاق ثابت والتصاق في ظل ظروف تدفق كما عمليتين تنظيمية متميزة. تنظيم الخلايا التائية التصاق يمكن وصفها بصورة أكثر إحكاما كما يخدعالتصيد الدولة تقارب من إنتغرين الجزيئات أعرب على سطح الخلية، وبالتالي تنظيم تفاعل integrins مع بروابط جزيء التصاق أعرب على سطح الخلية التفاعل. فهمنا الحالي للتنظيم حالات تقارب إنتغرين يأتي من كثير من الأحيان التبسيط في نظم نموذج المختبر. مقايسة للالتصاق تستخدم ظروف تدفق الموصوفة هنا يسمح لتصور وتقدير دقيق للتي التفاعلات خلية الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي بعد التحفيز. التصاق تحت فحص التدفق يمكن تطبيقها على دراسات من الالتصاق مما يشير إلى داخل الخلايا T بعد العلاج مع المواد المثبطة أو تنشيطية. بالإضافة إلى ذلك، هذا الاختبار يمكن توسيع خارج الخلايا التائية يشير إلى أية مجموعة من السكان لاصقة الكريات البيض وأي زوج جزيء إنتغرين التصاق.
Introduction
تي اللمفاويات التصاق يتوسط عددا من العمليات المتميزة في نظام صحي المناعي، 3 لعب أدوارا حاسمة في الاتجار الخلايا التائية وتقديم المستضد. سواء خلال مراقبة محصنة أو استجابة مناعية نشطة هذه دورين واسعة للالتصاق حاسمة. 4 أحداث الإشارات الفيزيولوجية للتي التفاعلات خلية خلية البطانية تختلف عن الخلايا التائية مستضد تقديم الخلية (APC) التفاعلات، وبالتالي تتطلب أساليب متميزة من دراسة لفهم أفضل السلاسل يشير المعنية. التصاق متين من الخلايا التائية لجدار الأوعية الدموية خلال تسرب لمفاوية يتطلب تفعيل إنتغرين سريع وديناميكي. التفاعل الوثيق بين نشط إنتغرين والتصاق جزيئات دولة على طول البطانة يؤدي إلى مقاومة لتدفق الدم التصاق، مما يسمح للخلايا T على الزحف على طول السطح بحثا عن مساحة متساهلة لمرور الخلية. 5 في الزحف من خلية ثنائية T -directionally ألونالجا جدار الأوعية الدموية وتعتمد على التصاق الاستقطاب، مع الواجهة الأمامية لاصقة متميزة من الخلايا التائية. 6 والأهم من ذلك، التصاق وطيد والتهجير تتطلب مقاومة لقوة القص الناتجة عن تعميم تدفق الدم.
عند تصميم التجارب لدراسة الخلايا اللمفاوية التصاق، وينبغي إيلاء الاهتمام لحافز معين من الاهتمام. في حين إنتغرين تفعيل هو عنصر مشترك وحاسم من كل أشكال الخلايا التائية الالتصاق، من المرجح أن تكون فريدة من نوعها المصب من مستقبلات الفردية وشارك في مستقبلات أجهزة الطرد المركزي من التنشيط. وعلى نحو مماثل، تعمل إنتغرين والتصاق جزيء أزواج في microenvironments المتخصصة وعلى القطعان محددة. وبهذه الطريقة، يمكن تنظيم هذه الأزواج بشكل مختلف تماما. والنموذج المقدم هنا هو المثالي لدراسة الإشارات شلالات مما يؤدي إلى إنتغرين تفعيل تجري في ظل ظروف إجهاد القص. 7 هذه التفاعلات لا يمكن أن يفهم على نحو كاف في اللصق ثابتعلى النظام بسبب تأثير وقد ثبت هذه القوات لديها مباشرة على سلوك الخلايا التائية. 8 وعلى الرغم من قدم هنا مع خلايا T وشو الخلايا (الصينية الهامستر المبيض) هندسيا للتعبير عن (خلايا CHO-ICAM) البشري ICAM-1 يمكن للنظام بسهولة يمكن تعديلها لدراسة مختلف السكان الكريات البيض أو جزيئات الالتصاق.
يوفر هذا الاختبار طريقة لتحديد تي الإلتصاق خلية وتفعيل إنتغرين باستخدام إجهاد القص، تقديم نموذج للمرحلة الالتصاق ثابتة من تسرب الكريات البيض. من خلال استخدام الخلايا CHO-ICAM تقارب من LFA-1 ليجند في الخلايا الحية يمكن فحص في الوقت الحقيقي في الاستجابة للمؤثرات مختلفة من الفائدة. هذا الأسلوب يتطلب الحصول عليها بسهولة، وهي متاحة تجاريا غرف تدفق الصغيرة في توليفة مع ضخ حقنة، وتبسيط كبير من المعدات اللازمة لنموذج تدفق الدم وإجهاد القص بالمقارنة مع النماذج الأخرى. 9 ميزة رئيسية أخرى من هذا الاختبار هو أن إشارات محددةشلالات وما يترتب عليها من الدولة تفعيل integrins الفردية يمكن دراسة نظيفة من خلال استخدام الخلايا CHO المهندسة التعبير عن جزيئات الالتصاق الإنسان من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجمع بين البيانات الكمية مع التصوير الخلية الحية هو ميزة كبيرة لهذا الأسلوب. وبشكل عام، في حين تم وصف عدد من المقايسات من ساكنة التصاق الخلايا التائية التي نموذج لطيف تفاعلات الخلايا التائية، APC، وهذه النماذج ليست كافية في الاستيلاء على عملية ديناميكية تي التصاق الخلايا الظهارية. لهذا السبب، عند اختيار مقايسة التصاق التحفيز في مسألة يجب النظر فيها.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل تحليل الخلايا التائية الالتصاق بشكل صحيح، ومنبه ليتم تضمينها في الدراسة يجب مراعاتها عند اختيار طريقة في المختبر. في حين أن هناك عدة فحوصات لدراسة الإشارات المؤدية إلى LFA-1 التنشيط وICAM-1 ملزمة كل الأساليب ليست قابلة للتبديل. والتصاق فحص ثابت 10 هو الأن…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
Materials
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
Referências
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides – based on numerical calculations. Application Note 11. , (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
