Analyse av Adhesjon Under skjærspenning for studier av T-lymfocytter-adhesjonsmolekyl Interactions

Summary

Denne strømnings adhesjonsassayet tilveiebringer en enkel, høy slag modell av T-celle-epitelial-celle-interaksjoner. En sprøytepumpe blir brukt til å generere skjærspenninger, og konfokal mikroskopi tar bilder for kvantifisering. Målet med disse studiene er å effektivt kvantifisere T-celle adhesjon ved hjelp av strømningsforhold.

Abstract

Totalt sett er T-celle adhesjon en kritisk komponent i funksjon, bidrar til de ulike prosessene i mobilnettet rekrutteringen til områder av betennelser og samhandling med antigenpresenterende celler (APC) i dannelsen av immunologiske synapser. Disse to sammenhenger av T-celle-adhesjon varierer i at T-celle-APC-interaksjoner kan betraktes som statiske, mens T-celle-interaksjoner blodkar blir utfordret av skjærspenningen generert av sirkulasjon i seg selv. T-celle-APC-interaksjoner er klassifisert som statisk ved at de to cellulære partnere er statisk i forhold til hverandre. Vanligvis skjer dette samspillet i lymfeknutene. Som en T-celle samhandler med blodet åreveggen, cellene arrestere og må motstå generert skjærspenning. ^1,2 Disse forskjellene markere behovet for å bedre forstå statisk feste og heft i henhold strømningsforhold som to forskjellige reguleringsprosesser. Reguleringen av T-celle adhesjon kan mest konsist beskrevet som controlling affiniteten tilstand av integrin-molekyler som uttrykkes på celleoverflaten, og derved regulere interaksjonen mellom integriner med adhesjonsmolekylet ligander som uttrykkes på overflaten av cellen i samspill. Vår nåværende forståelse av reguleringen av integrin affinitetstilstander kommer fra ofte forenklede in vitro modellsystemer. Analysen av adhesjon ved hjelp av strømnings-betingelser som er beskrevet her gjør det mulig for visualisering og nøyaktig kvantifisering av T-celle-epitelial-celle-interaksjoner i sann tid etter et stimulus. En adhesjon i henhold til strømnings analysen kan brukes til studier av adhesjon signalisering i løpet av T-celler etter behandling med hemmende eller stimulerende substanser. I tillegg kan denne analysen utvides utover T-celle-signalisering til en hvilken som helst klebemiddel leukocytt-populasjonen og eventuelle integrin-adhesjonsmolekyl par.

Introduction

T-lymfocytt adhesjon medierer en rekke forskjellige prosesser i et sunt immunsystem, ³ spiller viktige roller i T-celletrafikken og antigen presentasjon. Både ved immunovervåkning eller en aktiv immunrespons i disse to hovedroller for adhesjon er kritiske. ⁴ Den fysiologiske signaleringshendelser av T-celle-endotel-celle-interaksjoner er forskjellig fra T-celle-antigen-presenterende celle (APC) interaksjoner, og derfor krever forskjellige metoder for studie for å best forstå de signal kaskader involvert. Den faste adhesjon av en T-celle til en blodkarveggen under lymfocytt ekstravasasjon krever rask og dynamisk integrin-aktivering. Den stramme interaksjonen mellom en aktiv tilstand integrin og adhesjonsmolekyler langs endotelet fører til adhesjon motstandsdyktig mot strømmen av blod, slik at T-cellene til å krype langs overflaten på jakt etter et område som ettergivende til celle passasje. ⁵ den gjennomsøking av en T-celle-bi -directionally Alonga karveggen er avhengige på polarisert adhesjon, med en distinkt klebemiddel fremre ende av T-celle. ⁶ Viktigst, fast adhesjon og transmigrasjon krever motstand mot skjærkraften generert av sirkulerende blodstrøm.

Ved utforming eksperimenter for å studere lymfocytt heft, bør det tas hensyn til den spesifikke stimulans av interesse. Mens inte aktivering er en vanlig og viktig del av alle former for T-celle adhesjon, kaskader av aktivering er sannsynlig å være unik nedstrøms av individuelle reseptorer og co-reseptorer. Likeledes inte og adhesjonsmolekyl parene fungere i spesialiserte microenvironments og på bestemte subpopulasjoner. På denne måte kan disse parene reguleres ganske annerledes. Modellen som presenteres her er ideell for studiet av signaleringskaskader som fører til integrin-aktivering fant sted under skjærspenningsbetingelser. ^7. Disse interaksjonene ikke kan være tilstrekkelig forstås i en statisk lim;på systemet på grunn av virkningen disse styrkene har vist seg å ha rett på T-celle atferd. ⁸ Selv presenteres her med T-celler og CHO (kinesisk hamster) celler konstruert for å uttrykke menneskelige ICAM-1 (CHO-ICAM celler) den kan systemet enkelt modifiseres til å studere forskjellige leukocyttpopulasjonene eller adhesjonsmolekyler.

Denne analysen tilveiebringer en fremgangsmåte for å kvantifisere T-celle-klebrighet og integrin-aktivering ved hjelp av skjærspenning, som gir en modell for den faste adhesjon fasen av leukocytt-ekstravasasjon. Gjennom bruk av CHO-ICAM-celler affiniteten av LFA-1 til dets ligand i levende celler kan undersøkes i sanntid som respons på forskjellige stimuli av interesse. Denne teknikken krever lett oppnås, kommersielt tilgjengelige mikro-ningskammere i kombinasjon med en sprøytepumpe, mye enklere utstyr som er nødvendig for å modellere blodstrøm og skjærspenning i forhold til andre modeller. ⁹ En annen stor fordel med denne analysen er den bestemte signalkaskader og den resulterende aktiveringstilstanden av de enkelte integriner kan være rent studeres ved anvendelse av modifiserte CHO-celler som uttrykker humane adhesjonsmolekyler av interesse. Dessuten er kombinasjonen av kvantitative data med levende celle avbildning er en betydelig fordel ved denne metoden. Alt i alt, mens en rekke analyser av statisk T-celle-adhesjon, er blitt beskrevet som pent modell T-celle-APC-interaksjoner, disse modellene er utilstrekkelige for å fange den dynamiske prosessen med T-celle-epitelial adhesjon. Av denne grunn ved valg av adhesjonsanalysen stimulus aktuelle må vurderes.

Protocol

1. plating den CHO-ICAM Cells Merk: Målet med dette trinnet er å plate CHO-ICAM celler i strømnings kamre for vekst over natten med mål om å generere en konfluent monolag. Opprettholde CHO-ICAM-celler i 10 cm vev-kultur-behandlet kulturskåler i 10 ml RPMI-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (CHO-ICAM komplett kulturmedium) ved 37 ° C med 5% CO 2. For å samle cellene, tilsett 1 ml 0,5% trypsin-EDTA og inkuber ved værelsestempe…

Representative Results

Representative resultater er vist fra strømnings adhesjonsassayet ved hjelp av Jurkat og primære humane CD3 + T-celler, som angitt, stimulert med SDF-1α. De negative kontrollene i alle vist eksperimenter er ustimulerte celler. En terskel basal prosent adhesjon av ustimulerte celler ligger mellom 5 – 10%; basen adhesjon særlig over dette området indikerer en problematisk eksperiment og foreslår starten populasjon av T-celler ble ikke-spesifikt pre-aktivert under forberede…

Discussion

For å kunne analysere T-celle-adhesjon, sentralstimulerende å bli inkludert i studien må tas i betraktning ved valg av en in vitro-metode. Mens det er flere analyser for å studere signaler som fører til LFA-1-aktivering og ICAM-1-bindende alle metoder er ikke utskiftbare. En statisk vedheft analysen ¹⁰ er best egnet til å studere T-celle-APC interaksjoner; alternativt skjærspenningen metoden beskrevet her gjør det enkelt å modellere T-celle-epitelial celle-interaksjoner. In vivo, so…

Materials

T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950