Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones
Summary
Este ensayo de adhesión de flujo proporciona un modelo de impacto simple de la máxima de las interacciones célula-célula epitelial T. Una bomba de jeringa se utiliza para generar la tensión de cizallamiento, y la microscopía confocal captura imágenes para la cuantificación. El objetivo de estos estudios es cuantificar eficazmente la adhesión de células T usando condiciones de flujo.
Abstract
En general, la adhesión de las células T es un componente crítico de la función, contribuyendo a los distintos procesos de reclutamiento celular a los sitios de inflamación y la interacción con las células presentadoras de antígeno (APC) en la formación de sinapsis inmunológicas. Estos dos contextos de adhesión de las células T se diferencian en que las interacciones célula T-APC pueden considerarse estática, mientras que las interacciones de los vasos de la sangre por células T son desafiados por el esfuerzo cortante generada por la circulación en sí. interacciones de células T de APC se clasifican como estática en que los dos socios celulares son estáticos con relación al otro. Por lo general, esta interacción se produce dentro de los ganglios linfáticos. Como una célula T interactúa con la pared del vaso sanguíneo, las células detienen y deben resistir el esfuerzo cortante generado. 1,2 Estas diferencias ponen de manifiesto la necesidad de comprender mejor adherencia estática y la adherencia en condiciones de flujo como dos procesos distintos reguladores. La regulación de la adhesión de las células T se puede describir sucintamente como concurricán el estado afinidad de la integrina moléculas expresadas en la superficie celular, y regulando de este modo la interacción de las integrinas con los ligandos de moléculas de adhesión expresadas sobre la superficie de la célula que interactúan. Nuestra comprensión actual de la regulación de los estados de afinidad proviene de la integrina menudo simplista pt sistemas modelo in vitro. El ensayo de adhesión usando condiciones de flujo descrito aquí permite la visualización y la cuantificación exacta de las interacciones de células de células epiteliales T en tiempo real después de un estímulo. Una adhesión bajo ensayo de flujo se puede aplicar a los estudios de adhesión de señalización dentro de las células T después de tratamiento con sustancias inhibidoras o estimulantes. Además, este ensayo se puede ampliar más allá de la señalización de las células T a cualquier población de leucocitos adhesivo y cualquier par molécula de integrina adherencia.
Introduction
La adhesión de linfocitos T media una serie de procesos diferentes en un sistema inmunológico saludable, 3 juega un papel crítico en el tráfico de células T y la presentación de antígenos. Ya sea durante la vigilancia inmune o una respuesta inmune activa estas dos amplias funciones para la adhesión son críticos. 4 Los eventos de señalización fisiológicos de las interacciones de células de células endoteliales T son distintos de células T antígeno que presenta la célula (APC) interacciones, y por lo tanto requieren métodos distintos de estudio para entender mejor las cascadas de señalización implicadas. La adhesión firme de una célula T a una pared del vaso sanguíneo durante la extravasación de linfocitos requiere la activación rápida y dinámica de la integrina. La interacción estrecha entre un activo de moléculas de integrina y de adhesión del estado a lo largo del endotelio conduce a resistente al flujo de la sangre de adhesión, permitiendo que las células T para rastrear a lo largo de la superficie en busca de una zona propicia para el paso de la célula. 5 El rastreo de un bi células T -directionally Alonga pared del vaso sanguíneo es dependiente sobre la adhesión polarizado, con un extremo frontal adhesiva distinta de la célula T. 6 es más importante, la adhesión firme y la transmigración requieren resistencia a la fuerza de cizallamiento generada mediante la circulación de flujo sanguíneo.
En el diseño de experimentos para estudiar la adhesión de linfocitos, se debe prestar atención al estímulo específico de interés. Mientras activación de la integrina es un componente común y crítico de todas las formas de la adhesión de células T, las cascadas de activación es probable que ser único aguas abajo de los receptores individuales y co-receptores. Del mismo modo, los pares de integrina y la molécula de adhesión funcionan en microambientes especializados y en subpoblaciones específicas. De esta manera, estos pares pueden ser regulados de manera muy diferente. El modelo que aquí se presenta es ideal para el estudio de las cascadas que conducen a la activación de la integrina que tiene lugar bajo condiciones de estrés de cizalla de señalización. 7 Estas interacciones no pueden entenderse adecuadamente en un ADHESI estáticaen el sistema debido al impacto de estas fuerzas han demostrado tener directamente en el comportamiento de células T. 8 Aunque aquí se presenta con las células T y las células CHO (ovario de hámster chino) ingeniería genética para expresar (células CHO-ICAM) humano ICAM-1 El sistema puede ser fácilmente modificado para estudiar diferentes poblaciones de leucocitos o moléculas de adhesión.
Este ensayo proporciona un método para cuantificar la adhesividad de las células T y activación de la integrina usando tensión de corte, proporcionando un modelo para la etapa de la adhesión firme de la extravasación de leucocitos. A través del uso de las células CHO-ICAM la afinidad de LFA-1 para su ligando en células vivas se puede examinar en tiempo real en respuesta a diversos estímulos de interés. Esta técnica requiere obtiene fácilmente, cámaras de micro-de flujo disponible comercialmente en combinación con una bomba de jeringa, simplificando en gran medida el equipo necesario para modelar el flujo de sangre y el estrés de cizalladura en comparación con otros modelos. 9 Otra ventaja importante de este ensayo es que la señalización específicacascadas y el estado de activación resultante de las integrinas individuales pueden ser estudiados limpiamente a través de la utilización de células CHO que expresan moléculas de adhesión de ingeniería humanos de interés. Además, la combinación de los datos cuantitativos con imágenes de células vivas es una ventaja significativa de este método. En general, mientras que una serie de ensayos de adhesión de células T estática que se han descrito muy bien modelar las interacciones de las células T de APC, estos modelos son insuficientes para captar el proceso dinámico de la adhesión célula epitelial T. Por esta razón, la hora de elegir un ensayo de adhesión del estímulo en cuestión debe ser considerada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el fin de analizar adecuadamente la adhesión de células T, el estimulante que se incluirán en el estudio deben ser considerados al momento de elegir un método in vitro. Si bien hay varios ensayos para estudiar las señales que conducen a LFA-1 de activación y ICAM-1 de unión a todos los métodos no son intercambiables. Un ensayo de adhesión estática 10 es el más adecuado para estudiar las interacciones de las células T de APC; Alternativamente, el método de la tensión de cizallamiento…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
Materials
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
Referências
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