Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren
Summary
This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.
Abstract
Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.
Introduction
Die Proteinsynthese ist ein wesentlicher und energetisch kostspieliger Prozess in allen 1 – Zellen. Zuallererst Zellen müssen Energie in der Herstellung der Translationsmaschinerie, die Ribosomen investieren. Zum Beispiel erzeugt eine teilungsaktiven Hefezelle so viel wie 2000 Ribosomen pro Minute. Eine solche Produktion erfordert bis 60% der Gesamttranskriptionsaktivität und bis zu 90% der Gesamt Spleißen Aktivität der Zelle 2. Zusätzlich wird Energie für die Synthese von Aminosäuren, Aminoacyl-tRNA und Peptidbindungen erforderlich. In Pflanzen, das Hinzufügen einer Aminosäure einer Peptidkette Kosten 4,5-5,9 Moleküle ATP 3. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Translation von mRNA zu Protein ein wichtiger Ort der Regulierung, vor allem, wenn es mit wechselnden Umweltbedingungen fertig zu werden.
Die Einleitung Schritt der Übersetzung, dass die Assoziation einer mRNA mit dem Ribosom ist, ist das Hauptziel der RegulierungÜbersetzung 4. Als Folge der Regulation der Translation sowie andere post-transkriptionale regulatorische Schritte können nur 40% der Variationen in Proteinkonzentration von mRNA Menge 5,6 erläutert. So gibt die Studie der Gesamt-mRNA relativ schlechte Informationen über Protein Hülle und Fülle. Auf der anderen Seite gibt der Verband der mRNA mit Ribosomen besseren Einblick in die Proteinmenge durch den Zugang zu diesen in Translation beteiligt mRNAs zu geben. Aktiv werden übersetzt mRNAs mit mehreren Ribosomen in Strukturen genannt Polysomen assoziiert. Im Gegensatz dazu wird schlecht übersetzt mRNAs mit nur einem Ribosom (monosome) zugeordnet werden. Folglich kann die Translations Status einer mRNA durch Überwachung seiner Verbindung mit Ribosomen 7 ausgewertet werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Polysomen aus 6 Tage alten Arabidopsis thaliana Keimlinge, die anschließende Isolierung von RNA und die Analyse der Ergebnisse. Polysomes und monosomes werden durch einen Saccharose-Dichtegradienten getrennt. Gradienten werden in sechs Fraktionen gesammelt. Einige der Fraktionen werden vereinigt drei zu erhalten gut getrennten Fraktionen: Polysomen, monosomes und die Leichtfraktion (im Folgenden als Überstand), die enthält die freien 60S und 40S ribosomalen Untereinheiten und mRNAs, die nicht mit Ribosomen assoziiert. Globale Translationsaktivität kann durch Erzeugen eines Polysomen / monosome Verhältnis geschätzt werden, die durch Integration der Fläche unter der Kurve bestimmt wird, und durch die Polysomen Profilen verglichen wird. mRNAs und Proteine werden dann aus den verschiedenen Fraktionen und zur Analyse mittels RT-PCR, qRT-PCR, Northern Blot, Microarray, Western-Blot oder Proteomik extrahiert. Dieses Protokoll wurde für andere Pflanzen und Geweben validiert.
Das Gerät benötigt, um dieses Protokoll zu erfüllen sind häufig in den meisten Labors gefunden: Es besteht keine Notwendigkeit für einen Gradienten ausgestattet. Einfrieren jede Schicht bevor die nächste Zugabe verhinderns aus einem Mix oder Störung der Schichten. Kein Schlauch piercer für Gradienten Sammlung verwendet, die durch Eintauchen eines Glaskapillarrohres in dem Gradienten erreicht werden kann. Daher bleiben die teuren Ultrazentrifugenröhrchen unbeschädigt und wiederverwendet oft werden kann. Zusammen macht dies das vorliegende Protokoll eine einfache und billige Methode für Polysoms Profilierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Französisch nationalen Forschungsagentur (ANR-14-CE02-0010) unterstützt. Wir danken Dr. Benjamin Field und Dr. Elodie Lanet für das kritische Lesen des Manuskripts. Wir danken Herrn Michel Terese für seine Hilfe bei Videobearbeitung.
Materials
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
Referências
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