שיטה קלה הצמח Polysome Profiling
Summary
This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.
Abstract
Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.
Introduction
סינתזת חלבון היא תהליך חיוני ויקר במרץ בכל התאים 1. קודם כל, התאים חייבים להשקיע אנרגיה בייצור של מכונות תרגום, הריבוזומים. לדוגמא תא שמרים שעדיין מתחלק מייצר ככל 2,000 ריבוזומים לדקה. כזה הייצור דורש עד 60% של פעילות תעתיק הכולל עד 90% מהפעילות שחבור הכולל של התא 2. בנוסף, אנרגיה נדרשת לסינתזה של חומצות אמינו, aminoacyl-tRNA ו קשרים פפטידיים. בצמחים, הוספת חומצה אמינית אחת על עלויות שרשרת הפפטיד מן 4.5 ל 5.9 מולקולות של ATP 3. לכן, אין זה מפתיע כי התרגום של mRNA לחלבון הוא אתר עיקרי של רגולציה, במיוחד כאשר מדובר בהתמודדות עם תנאי סביבה משתנה.
צעד החניכה של תרגום, כלומר את שיוכה של mRNA עם הריבוזום, הוא המטרה העיקרית של ההסדרהתרגום 4. כתוצאה מכך של הסדרת התרגום וכן צעדים רגולטוריים שלאחר תעתיק אחרים, רק 40% של וריאציות בריכוז החלבון יכול להיות מוסבר על ידי mRNA שפע 5,6. לכן, המחקר של mRNA הכולל נותן מידע עני יחסית על שפע חלבון. מצד שני, העמותה של mRNA עם ריבוזומים נותן תובנות טובות יותר שפע החלבון על ידי מתן גישה mRNAs המעורבים התרגום. mRNAs המתורגם באופן פעיל משויך כמה ריבוזומים במבנים שנקראו polysomes. לעומת זאת, mRNAs מתורגם גרוע ישויך רק אחד הריבוזום (monosome). כתוצאה מכך, מעמדם translational של mRNA יכול להיות מוערך על ידי מעקב אחר הקשר שלה עם ריבוזומים 7.
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של polysomes מן שתילי thaliana ארבידופסיס בת שישה ימים, הבידוד הבא של RNA, ואת ניתוח התוצאות. Polysomes ו monosomes מופרדים באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז. הדרגתיים נאספים לשישה שברים. חלק מן השברים הם אספו להשיג שלושה שברים מופרדים היטב: polysomes, monosomes ואת שבריר אור (הנקרא להלן supernatant), אשר מכיל את יחידות משנה ריבוזומלי 60S ו 40S בחינם mRNAs שאינם משויכים עם ריבוזומים. ניתן לאמוד פעילות תרגום עולמית על ידי יצירת יחס polysome / monosome, אשר נקבע על ידי שילוב של השטח מתחת לעקומה, ועל ידי השוואת פרופילי polysomes. mRNAs וחלבונים אז המחולצים שברים שונים ומשמש לניתוח על ידי RT-PCR, qRT-PCR, כתם הצפון, microarray, כתם או פרוטאומיקה המערבי. פרוטוקול זה יאומת לצמחים ורקמות אחרים.
הציוד נדרש לבצע פרוטוקול זה מצוי לרוב ברוב המעבדות: אין צורך לעושה שיפוע. הקפאת כל שכבה לפני הוספת הבאה למנועs מכל תערובת או הפרעה של השכבות. לא דוקר צינור משמש לאיסוף שיפוע אשר יכול להיות מושגת על ידי טבילה של צינור נימי זכוכית של ההדרגה. לכן, צינורות ultracentrifuge יקר להישאר ניזוק וניתן להשתמש בהן שוב ושוב פעמים רבות. ביחד, זה הופך את הפרוטוקול הנוכחי שיטה קלה וזולה עבור פרופיל polysome.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות למחקר הלאומית הצרפתית (ANR-14-CE02-0010). אנו מודים ד"ר בנימין שדה וד"ר אלודי Lanet לקריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים למר מישל תרז על עזרתו עם עריכת וידאו.
Materials
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
Referências
- Nelson, C. J., Millar, A. H. Protein turnover in plant biology. Nat Plants. 1 (3), 15017 (2015).
- Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
- Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
- Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
- Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
- Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. . Arabidopsis protocols. , (2006).
- Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314 (2009).
- Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. Polysome Profiling Analysis. bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
- Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
- Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
- Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), (2010).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
