Un metodo facile per piante polysome Profiling
Summary
This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.
Abstract
Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.
Introduction
La sintesi proteica è un processo essenziale e energeticamente costosa in tutte le cellule 1. Prima di tutto, le cellule devono investire energie nella produzione delle macchine di traduzione, i ribosomi. Per esempio una cellula di lievito che divide attivamente produce fino a 2.000 ribosomi al minuto. Tale produzione richiede fino al 60% del totale attività trascrizionale e fino al 90% dell'attività splicing totale della cella 2. Inoltre, l'energia è necessaria per la sintesi di amminoacidi,-tRNA e legami peptidici. Nelle piante, l'aggiunta di un aminoacido ad un costo catena peptidica da 4,5 a 5,9 molecole di ATP 3. Pertanto, non è sorprendente che la traduzione di mRNA di proteina è un importante sito di regolazione, in particolare quando si tratta di trattare con mutevoli condizioni ambientali.
Il passo inizio della traduzione, che è l'associazione di un mRNA con il ribosoma, è l'obiettivo principale del regolamento ditraduzione 4. Come conseguenza della regolazione della traduzione nonché altri passaggi normativi post-trascrizionale, solo il 40% delle variazioni della concentrazione di proteine può essere spiegato con mRNA abbondanza 5,6. Così, lo studio di mRNA totale fornisce informazioni relativamente scarsa su l'abbondanza di proteine. D'altra parte, l'associazione di mRNA con ribosomi dà una migliore comprensione abbondanza di proteine, dando accesso a tali mRNA coinvolti nella traduzione. mRNA attivamente tradotti sono associati a diversi ribosomi in strutture chiamate polisomi. Al contrario, mRNA mal tradotti saranno associati con una sola ribosoma (monosome). Di conseguenza, lo stato traduzionale di mRNA può essere valutata monitorando la sua associazione con ribosomi 7.
Questo protocollo descrive l'isolamento di polisomi da sei giorni piantine Arabidopsis thaliana, il successivo isolamento di RNA, e l'analisi dei risultati. Polysomes e monosomes sono separati attraverso un gradiente di densità di saccarosio. Le sfumature sono raccolti in sei frazioni. Alcune delle frazioni viene riunito per ottenere tre frazioni ben separati: polisomi, monosomes e la frazione leggera (di seguito denominato surnatante), che contiene le libere 60 e 40S subunità ribosomiale e mRNA che non sono associati con i ribosomi. attività di traduzione globale può essere stimato generando un rapporto segnale / rumore monosome polysome, che è determinata dalla integrazione dell'area sotto la curva, e confrontando i profili polisomi. mRNA e le proteine vengono poi estratte da diverse frazioni e utilizzati per l'analisi mediante RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, microarray, macchia occidentale o la proteomica. Questo protocollo è stato convalidato per altre piante e tessuti.
Il materiale necessario per effettuare questo protocollo si trovano comunemente nella maggior parte dei laboratori: Non vi è alcuna necessità di un creatore di gradiente. Congelamento ogni strato prima di aggiungere il successivo prevenires da qualsiasi miscela o disturbo degli strati. N perforatore tubo è utilizzato per la raccolta di gradiente che può essere raggiunto mediante immersione di un tubo capillare di vetro nel gradiente. Pertanto, i tubi ultracentrifuga costose rimangono integre e possono essere riutilizzati più volte. Collettivamente, questo rende il presente protocollo un metodo semplice ed economico per il profiling polysome.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agenzia Nazionale della Ricerca francese (ANR-14-CE02-0010). Ringraziamo il dottor Benjamin campo e il Dr. Elodie Lanet per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo il Sig Michel Terese per il suo aiuto con il video editing.
Materials
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
Referências
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