工場ポリソームプロファイリングのための簡単な方法
Summary
This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.
Abstract
Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.
Introduction
タンパク質合成は、すべてのセル1において不可欠とエネルギー的にコストのかかるプロセスです。まず第一に、細胞は、翻訳機構、リボソームの生産にエネルギーを投資しなければなりません。例えば、活発に分裂酵母細胞は毎分ほど2,000リボソームを生成します。このような生産は、総転写活性の60％及びセル2の全スプライシング活性の最大90％までを必要とします。また、エネルギーは、アミノ酸、アミノアシルtRNAおよびペプチド結合の合成に必要とされます。植物では、ATP 3の4.5〜5.9分子からペプチド鎖コスト1つのアミノ酸を付加します。したがって、変化する環境条件に対処することになる場合は特に、タンパク質へのmRNAの翻訳を調節する主要な部位であることは驚くべきことではありません。
リボソームとmRNAの関連で翻訳の開始段階では、規制の主なターゲットであります翻訳4。翻訳の調節の結果、ならびに他の転写後調節ステップとして、タンパク質濃度の変動の40％のみがmRNA量5,6によって説明することができます。このように、全mRNAの研究は、タンパク質存在量についての比較的低い情報を提供します。一方、リボソームとmRNAの関連は、翻訳に関与するそれらのmRNAへのアクセスを与えることによって、タンパク質存在量より深い洞察を提供します。積極的に翻訳されたmRNAはポリソームと呼ばれる構造で、いくつかのリボソームに関連付けられています。逆に、不十分な翻訳mRNAは唯一のリボソーム（モノソーム）に関連付けられます。その結果、mRNAの翻訳状態はリボソーム7との会合をモニターすることによって評価することができます。
このプロトコルは、6日齢のシロイヌナズナの苗、RNAのその後の単離、および結果の分析からポリソームの単離を記載しています。ポー川lysomesとmonosomesは、ショ糖密度勾配を介して分離されています。勾配は6画分に回収されます。ポリソーム、monosomesおよび軽質留分（以下、上澄み液と呼ばれる）、リボソームに関連付けられていないフリーの60Sおよび40SリボソームサブユニットとのmRNAが含まれています：画分の一部は、3つのよく分離された画分を得るためにプールされています。グローバル翻訳活性、およびポリソームプロファイルを比較することにより、曲線下面積の積分によって決定されるポリソーム/モノソーム比を生成することによって推定することができます。 mRNAおよびタンパク質は、次いで、異なる画分から抽出し、RT-PCR、定量RT-PCR、ノーザンブロット、マイクロアレイ、ウエスタンブロットまたはプロテオミクスによる分析のために使用されます。このプロトコルは、他の植物との組織のために検証されています。
このプロトコルを実行するために必要な装置は、一般に、ほとんどの実験室で見られる：勾配メーカーは必要ありません。次のいずれかの防止加える前に、それぞれの層を凍結層の任意の組合せや外乱からの。いいえ管穿孔は、勾配のガラス毛細管を浸漬することによって達成することができる傾斜収集のために使用されません。したがって、高価な超遠心管が無傷のままであり、何度も再利用することができます。まとめると、これは本プロトコルポリソームプロファイリングのための簡単かつ安価な方法になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、フランス国立研究機構（ANR-14-CE02-0010）によってサポートされていました。私たちは、原稿の重要な読書のための博士ベンジャミン・フィールド博士エロディLanetに感謝します。私たちは、ビデオ編集との彼の助けのために氏ミシェル・テレーズに感謝します。
Materials
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
Referências
- Nelson, C. J., Millar, A. H. Protein turnover in plant biology. Nat Plants. 1 (3), 15017 (2015).
- Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
- Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
- Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
- Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
- Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. . Arabidopsis protocols. , (2006).
- Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314 (2009).
- Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. Polysome Profiling Analysis. bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
- Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
- Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
- Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), (2010).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
