Um método fácil para a planta polysome Profiling

Summary

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Abstract

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

Introduction

A síntese de proteínas é um processo essencial e dispendiosa energeticamente em todas as células ^1. Em primeiro lugar, as células devem investir energia na produção da maquinaria de tradução, os ribossomas. Por exemplo, uma célula de levedura dividindo ativamente produz tanto quanto 2.000 ribossomas por minuto. Essa produção exige até 60% da actividade de transcrição total e até 90% da actividade total de splicing da célula ^2. Além disso, é necessária energia para a síntese de aminoácidos, aminoacil-ARNt e ligações peptídicas. Nas plantas, a adição de um aminoácido a uma cadeia peptídica custos de 4,5 a 5,9 moléculas de ATP ^3. Portanto, não é surpreendente que a tradução do mRNA para a proteína é um importante local de regulação, especialmente quando se trata de lidar com a mudança de condições ambientais.

A etapa de iniciação da tradução, que é a associação de um mRNA com o ribossoma, é o principal alvo da regulamentação dosTradução ^4. Como uma consequência da regulação da tradução, bem como outros passos de regulação pós-transcricional, apenas 40% das variações na concentração de proteína pode ser explicada por ARNm de abundância ^5,6. Assim, o estudo de mRNA total fornece relativamente pouca informação sobre a abundância de proteínas. Por outro lado, a associação de mRNA com ribossomos dá melhor visão sobre a abundância de proteínas, dando acesso a esses mRNAs envolvidos na tradução. mRNAs activamente traduzida estão associados com vários ribossomas em estruturas chamadas polissomas. Por outro lado, mRNAs mal traduzidas será associado a apenas um ribossomo (monosome). Por conseguinte, o status translacional de um ARNm pode ser avaliado por monitorização da sua associação com ribossomas ^7.

Este protocolo descreve o isolamento de polissomas a partir de seis dias de idade plântulas de Arabidopsis thaliana, o subsequente isolamento do ARN e a análise dos resultados. Polysomes monosomes e são separadas através de um gradiente de densidade de sacarose. Gradientes são coletados em seis fracções. Algumas das fracções são reunidas para obter três fracções bem separados: polissomos, monosomes ea fração leve (doravante denominado sobrenadante), que contém os 60 e 40S subunidades ribossomais livres e mRNAs que não estão associados a ribossomas. actividade de tradução global pode ser estimada através da geração de uma relação de polissoma / monosome, que é determinada por integração da área sob a curva, e por comparação dos perfis de polissomas. ARNm e as proteínas são, em seguida, extraiu-se a partir das diferentes fracções e utilizado para análise por RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, microarray, Western blot ou proteómica. Este protocolo foi validado para outras plantas e tecidos.

Os equipamentos necessários para realizar este protocolo são comumente encontrados na maioria dos laboratórios: Não há necessidade de uma máquina de inclinação. Congelação cada camada antes de adicionar o próximo prevenirs de qualquer mistura ou perturbação das camadas. Nenhuma perfurador tubo é utilizado para a recolha de inclinação que pode ser obtida por imersão de um tubo capilar de vidro no gradiente. Por conseguinte, os tubos de ultracentrífuga dispendiosos não ficam danificadas e podem ser re-utilizada várias vezes. Coletivamente, isso faz com que o presente protocolo de um método fácil e barato para profiling polysome.

Protocol

1. Preparação de 20 a 50% (p / v) de sacarose Gradientes Nota: Os gradientes são feitos de 4 camadas de sacarose (50%, 35% e 2 camadas de 20%) em 13,2 ml de um tubo de ultracentrífuga. Em nossa experiência, despejando a sacarose 20% em duas camadas separadas melhora muito a qualidade das preparações polissomas. Preparar as soluções de estoque. Certifique-se que todas as soluções são RNAse e DNAse livre. Prepare 10X Solução Salina: Tris-HCl 400 pH 8,4, KCl 20…

Representative Results

Na literatura, os perfis de polissomas são mostrados frequentemente a partir da fracção de luz para a fracção pesada como um resultado da forma como os gradientes são recolhidos, ou seja, a partir do topo para o fundo. Uma vez que no protocolo aqui descrito os gradientes são recolhidos a partir da base para o topo, os perfis que mostram começar com a fração pesada (as polissomos) e vá para a fração de luz (subunidades de ribossomas livres e RNAs) (Figura 2A).</strong…

Discussion

The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent¹¹ and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…

Materials

Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml	Beckman Coulter	331372
Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml	Beckman Coulter	326823
Glass capillary tube	Drummond Scientific	1-000-1000
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima series
Ultracentrifuge Rotor SW41	Beckman Coulter	331362
Ultracentrifuge Rotor SW32	Beckman Coulter	369650
Peristaltic pump	Any
Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing	Fisher Scientific	070534-22	Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm
Fraction collector Model 2110	Bio-Rad	731-8120
UV cuvette	Hellma	170.700-QS	Quartz flow-through cuvette
UV Spectrophotometer	Varian	Cary50	Read every 0.0125 sec
All chemicals	Any		Use only Molecular Biology Grade
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Rnase-Free water	Any
Petri Dishes	Fisher Scientific	10083251
Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Linear acrylamide (acryl carrier)	ThermoFischer scientific	AM9520	RNA precipitation carrier
OriginPro 8	OriginLab		Analysis software