This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.
Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.
Eiwitsynthese is een essentieel en energetisch kostbaar proces in alle cellen 1. Allereerst moeten cellen energie in de productie van de translatie machinerie, de ribosomen. Bijvoorbeeld een actief delende gistcel produceert zoveel 2000 ribosomen per minuut. Deze productie is maximaal 60% van de totale transcriptionele activiteit en tot 90% van de totale splicing activiteit van de cel 2. Bovendien wordt energie gebruikt voor de synthese van aminozuren, aminoacyl-tRNA en peptidebindingen. In planten, het toevoegen van een aminozuur aan een peptideketen kosten 4,5-5,9 moleculen ATP 3. Daarom is het niet verwonderlijk dat de vertaling van mRNA tot eiwit is een belangrijke plaats van de regelgeving, met name als het gaat om het omgaan met veranderende omgevingsfactoren.
De initiatie stap van de vertaling, dat is de vereniging van een mRNA met het ribosoom, is het belangrijkste doelwit van de regulering van devertaling 4. Als gevolg van de regulering van translatie en andere post-transcriptionele regulerende stappen, kan slechts 40% van de variaties in eiwitconcentratie te verklaren door mRNA overvloed 5,6. Zo is de studie van het totale mRNA geeft relatief slechte informatie over eiwit overvloed. Aan de andere kant, de vereniging van mRNA met ribosomen geeft een beter inzicht in eiwit overvloed door het geven van toegang tot die mRNA's die betrokken zijn bij de vertaling. Actief vertaald mRNA's geassocieerd met een aantal ribosomen structuren genaamd polysomen. Omgekeerd zal slecht vertaald mRNA's geassocieerd worden met slechts één ribosoom (monosome). Bijgevolg kan de translationele status van mRNA geëvalueerd door monitoring de associatie met ribosomen 7.
Dit protocol beschrijft de isolatie van polysomen zes dagen oud Arabidopsis thaliana zaailingen, de daaropvolgende isolatie van RNA en de analyse van de resultaten. polysomes en monosomes worden gescheiden door een sucrose dichtheidsgradiënt. Verlopen worden verzameld in zes fracties. Enkele fracties worden samengevoegd tot drie goed gescheiden fracties te verkrijgen: polysomen, monosomes en de lichte fractie (hierna supernatant), waarin het vrije 60S en 40S ribosomale subeenheden en mRNA's die niet zijn gekoppeld aan ribosomen bevat. Global vertaling activiteit kan worden bepaald door het genereren van een polysoom / monosome verhouding die wordt bepaald door integratie van het gebied onder de curve, en door vergelijking van de polysomen profielen. mRNA's en eiwitten worden geëxtraheerd uit de verschillende fracties en gebruikt voor analyse door RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, microarray, western blot of proteomics. Dit protocol is gevalideerd voor andere planten en weefsels.
De voor dit protocol voeren materiaal worden aangetroffen in de meeste laboratoria: Er is geen behoefte aan een gradiënt maker. Bevriezing elke laag voor het toevoegen van het volgende voorkomens uit een mix of verstoring van de lagen. Nr buis piercer wordt gebruikt gradiënt collectie die kan worden bereikt door onderdompeling van een glazen capillaire buis in het verloop. Daarom is de kostbare ultracentrifugebuizen onbeschadigd blijven en kunnen worden hergebruikt vaak. Collectief, dit maakt het huidige protocol een gemakkelijke en goedkope methode voor het polysoomdisplays profilering.
The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Franse National Research Agency (ANR-14-CE02-0010). Wij danken Dr Benjamin Field en Dr. Elodie Lanet voor kritische lezing van het manuscript. We danken de heer Michel Terese voor zijn hulp met video editing.
Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
Peristaltic pump | Any | ||
Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
Rnase-Free water | Any | ||
Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |