Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling
Summary
This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.
Abstract
Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.
Introduction
La synthèse des protéines est un processus essentiel et coûteux en énergie dans toutes les cellules 1. Tout d'abord, les cellules doivent investir de l'énergie dans la production de la machine de traduction, les ribosomes. Par exemple, une cellule de levure divisant activement produit jusqu'à 2000 ribosomes par minute. Une telle production nécessite jusqu'à 60% de l'activité totale de la transcription et jusqu'à 90% de l'activité totale de raccordement de la cellule 2. En outre, l'énergie est nécessaire pour la synthèse des acides aminés, des aminoacyl-ARNt et des liaisons peptidiques. Chez les plantes, l' ajout d' un acide aminé à un coût de la chaîne peptidique de 4,5 à 5,9 molécules d'ATP 3. Par conséquent, il est peu surprenant que la traduction de l'ARNm de la protéine est un site majeur de la réglementation, notamment en matière de traitement des conditions environnementales changeantes.
L'étape d'initiation de la traduction, qui est l'association d'un ARNm avec le ribosome, est la cible principale de la régulation desTraduction 4. En conséquence de la régulation de la traduction, ainsi que d' autres mesures réglementaires post-transcriptionnel, seulement 40% des variations de la concentration de protéine peut être expliquée par l'abondance d' ARNm 5,6. Ainsi, l'étude de l'ARNm total donne relativement peu d'informations sur les protéines d'abondance. D'autre part, l'association de l'ARNm aux ribosomes donne une meilleure idée de l'abondance des protéines en donnant accès à ces ARNm impliqués dans la traduction. ARNm traduit activement sont associés à plusieurs ribosomes dans des structures appelées polysomes. A l'inverse, les ARNm mal traduits seront associés à un seul ribosome (monosome). Par conséquent, le statut de la traduction d'un ARNm peut être évaluée en surveillant son association avec les ribosomes 7.
Ce protocole décrit l'isolement de polysomes de six jours plants âgés d' Arabidopsis thaliana, l'isolement ultérieur de l' ARN et l'analyse des résultats. Polysosomes et les monosomes sont séparés par un gradient de densité de saccharose. Dégradés sont recueillies en six fractions. Certaines des fractions sont réunies pour obtenir trois fractions bien séparées: polysomes, monosomes et la fraction légère (ci-après appelé surnageant), qui contient les libres 60S et 40S sous-unités ribosomiques et ARNm qui ne sont pas associés à des ribosomes. l'activité de traduction globale peut être évaluée en générant un polysomes rapport signal / bruit de monosome, qui est déterminé par intégration de l'aire sous la courbe, et en comparant les profils de polysomes. ARNm et les protéines sont ensuite extraits des différentes fractions et utilisées pour l'analyse par RT-PCR, la qRT-PCR, transfert de type Northern, puces à ADN, transfert ou protéomiques occidental. Ce protocole a été validé pour d'autres plantes et tissus.
L'équipement nécessaire pour effectuer ce protocole sont couramment dans la plupart des laboratoires: Il n'y a pas besoin d'une machine à gradient. Congélation chaque couche avant d'ajouter la suivante prévenirs de tout mélange ou de perturbation des couches. Aucun tube perforateur est utilisé pour la collecte de gradient qui peut être obtenue par immersion d'un tube capillaire en verre dans le gradient. Par conséquent, les tubes d'ultracentrifugation coûteux restent intacts et peuvent être réutilisés plusieurs fois. Collectivement, ce qui rend le présent protocole d'une méthode facile et pas cher pour le profilage polysomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'Agence Nationale de la Recherche française (ANR-14-CE02-0010). Nous remercions le Dr Benjamin champs et le Dr Elodie Lanet pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions M. Michel Terese pour son aide avec le montage vidéo.
Materials
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
Referências
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