Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol
Summary
Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Abstract
Maximaliseren van het voordeel van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) voor onderzoek, ziektemodel, farmaceutische en klinische toepassingen vereist robuuste werkwijzen voor de grootschalige productie van functionele celtypes, waaronder hartspiercellen. Hier laten we zien dat de temporele manipulatie van WNT, TGF-β en SHH signaalwegen leidt tot zeer efficiënte cardiomyocyt differentiatie van eencellige door passage HPSC lijnen in zowel statische suspensie en geroerde suspensie bioreactorsystemen. Gebruikmakend van deze strategie heeft geleid tot ~ 100% kloppend bolletjes, consistent met> 80% troponine T-positieve cellen na 15 dagen van de cultuur, gevalideerd in meerdere HPSC lijnen. Wij rapporteren ook een variatie van dit protocol voor gebruik met cellijnen nog niet aangepast aan eencellige passage, waarvan het succes is geverifieerd in 42 HPSC lijnen. Hartspiercellen gegenereerd met behulp van deze protocollen uit te drukken lineage-specifieke markers en tonen verwacht electrophysiological functionaliteiten. Ons protocol biedt een eenvoudige, efficiënte en robuuste platform voor de grootschalige productie van humane hartspiercellen.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), waaronder humane embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), het vermogen van zelf-vernieuwing en het vermogen om te differentiëren in cellen van de drie embryonale kiemlagen 1,2. Vanwege deze kenmerken hPSCs een waardevolle en onbeperkte bron voor het genereren en schaalbare ziekte-relevante celtypen te modelleren menselijke ziekte 3-5, voor high-throughput screening van geneesmiddelen en toxiciteitstests 6,7 en potentieel voor klinische toepassingen 8 . Genereren van hartspiercellen uit hPSCs biedt de mogelijkheid om specifiek onderzoek naar de mechanismen van complexe menselijke hart- en vaatziekten en de mogelijke behandelingen eerder buiten het bestek van onze mogelijkheden vanwege het gebrek aan relevante diermodellen en / of de beschikbaarheid van primaire aangetaste weefsels.
Alle bovengenoemde toepassingen van hPSCs necessitate de productie van grote aantallen van hoogverrijkt en functionele hartspiercellen. Zo is de beschikbaarheid van een efficiënte, reproduceerbare en schaalbaar in vitro cardiale differentiatie protocol geschikt voor meerdere HPSC lijnen is van cruciaal belang. Conventionele cardiomyocyten differentiatie protocollen hebben verschillende strategieën toegepast, zoals embryoid lichaam formatie 9, co-kweektechnieken 10, inductie met cocktails van cytokinen 11 en eiwittransductiedomein methoden 12. Ondanks de vooruitgang in deze technieken, de meeste nog steeds last van slechte efficiency, vereisen dure groeifactoren, of aan te bieden beperkte universaliteit bij een poging om meerdere HPSC lijnen te gebruiken. Tot op heden zijn hieraan grenzen aan de productie van HPSC-afgeleide cardiomyocyten voor celtherapie studies in diermodellen en in de farmaceutische industrie voor geneesmiddelenonderzoek 13 ingesteld. Daarom is de ontwikkeling van robuuste en betaalbare technieken voor grote-schaal productie van functionele HPSC-afgeleide hartspiercellen in schaalbare kweeksystemen zou grotendeels hun commerciële en klinische toepassingen te vergemakkelijken.
In dit manuscript beschrijven we de ontwikkeling van een rendabele en geïntegreerde cardiale differentiatie systeem met hoge efficiëntie, reproduceerbaarheid en toepasbaarheid voor hESCs en hiPSCs gegenereerd uit een verscheidenheid aan bronnen en kweekwerkwijzen, zoals een werkwijze voor de grootschalige productie van zeer verrijkte populaties van HPSC-afgeleide cardiomyocyten onder toepassing van een bioreactor. Daarnaast hebben we dit protocol voor HPSC lijnen niet aangepast aan gratis en / of enkele celkweek voeder, zoals de nieuw opgerichte hiPSCs of grote cohorten van HPSC lijnen de analyse van de ziekte mechanisme relevant geoptimaliseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cardiomyocyten afgeleid van hPSCs is een zeer aantrekkelijke bron voor toepassing bij humane ziektemodel, drug screening / toxiciteitstests en, misschien in de toekomst regeneratieve therapieën. Een van de belangrijkste obstakels het gebruik van deze cellen is echter de mogelijkheid om voldoende hoogwaardig materiaal voor het daadwerkelijk gebruik. Met behulp van onze beschreven protocol, bieden wij een methode die deze beperking overwint.
Onlangs hebben synthetische kleine moleculen gerich…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Materials
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
Referências
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
- Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
- Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
- Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
- Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
- Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
- Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
- Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
- Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
- Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
- Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
- McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
- Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
- Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
- Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).
