Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll
Summary
Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Abstract
Maximierung der Nutzen der menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) für Forschung, Krankheitsmodelle, pharmazeutische und klinische Anwendungen erfordert robuste Verfahren für die großtechnische Produktion von funktionellen Zelltypen, einschließlich Kardiomyozyten. Hier zeigen wir, dass die zeitliche Manipulation von WNT, TGF-β und SHH-Signalwege führt zu einer hocheffizienten cardiomyocyte Differenzierung von Einzelzell-passagierten HPSC Linien in sowohl statische Suspension und gerührten Suspension Bioreaktorsysteme. Bei Anwendung dieser Strategie führte zu ~ 100% schlagen Sphäroiden, konsequent mit> 80% kardiales Troponin T-positiven Zellen nach 15 Tagen der Kultur, validiert in mehreren HPSC Linien. Wir berichten auch auf eine Variante dieses Protokolls für die Verwendung mit Zelllinien derzeit nicht Passagierung Einzelzell angepasst, deren Erfolg in 42 HPSC Linien überprüft wurde. erzeugt Kardiomyozyten mit Hilfe dieser Protokolle ausdrücken linienspezifischen Markern und Show erwartet electrophysiologische Funktionalitäten. Unser Protokoll stellt eine einfache, effiziente und robuste Plattform für die großtechnische Produktion von humanen Kardiomyozyten.
Introduction
Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), einschließlich humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierte pluripotenter Stammzellen (hiPSCs), haben die Fähigkeit der Selbsterneuerung und die Fähigkeit , in Zellen der drei embryonalen Keimschichten 1,2 zu differenzieren. Aufgrund dieser Eigenschaften bieten hPSCs eine wertvolle und unbegrenzte Quelle für die Erzeugung und skalierbare Produktion von krankheitsrelevanten Zelltypen für die menschliche Krankheit Modellierung 3-5, für Hochdurchsatz – Wirkstoff – Screening und Toxizitätsassays 6,7 und potenziell für klinische Anwendungen 8 . Die Erzeugung von Kardiomyozyten aus hPSCs bietet die Möglichkeit, gezielt die Mechanismen der komplexen menschlichen Herz-Kreislauf- Erkrankungen und deren mögliche Behandlungen zu untersuchen, die zuvor über den Rahmen unserer Möglichkeiten aufgrund des Fehlens von relevanten Tiermodellen und / oder die Verfügbarkeit der betroffenen Primärgewebe.
Alle der oben genannten Anwendungen von hPSCs necessitate die Produktion von massiven Zahlen von hoch angereichertem und funktionellen Kardiomyozyten. Somit ist die Verfügbarkeit eines effizienten, reproduzierbaren und skalierbaren in vitro kardialen Differenzierungs Protokoll geeignet für mehrere Linien HPSC entscheidend. Herkömmliche Kardiomyozytendifferenzierung Protokolle haben unterschiedliche Strategien wie Embryoidkörperbildung Bildung 9, Co-Kulturtechniken 10, Induktion mit Cocktails von Zytokinen 11 und Proteintransduktion Verfahren verwendet 12. Trotz der Fortschritte bei diesen Techniken, die meisten leiden immer noch unter schlechten Wirkungsgrad, erfordern teure Wachstumsfaktoren oder begrenzte Universalität bieten bei dem Versuch, mehrere HPSC Linien zu verwenden. Bis heute haben diese Herausforderungen Grenzen für die Produktion von HPSC abgeleitete Kardiomyozyten für die Zelltherapie – Studien in Tiermodellen festgelegt, sowie in der pharmazeutischen Industrie für Wirkstoffforschung 13. Daher ist die Entwicklung von robusten und erschwinglichen Techniken für große-Skala Herstellung von funktionellen HPSC abgeleitete Kardiomyozyten in skalierbaren Kultursystemen würden ihre kommerziellen und klinischen Anwendungen weitgehend erleichtern.
In diesem Manuskript berichten wir die Entwicklung eines kosteneffektiven und integrierte kardialen Differenzierungssystem mit hoher Wirksamkeit, Reproduzierbarkeit und Anwendbarkeit auf hESCs und hiPSCs aus einer Vielzahl von Quellen und Kulturverfahren erzeugt werden, einschließlich eines Verfahrens für die Herstellung im großen Maßstab von hoch angereicherten Populationen von HPSC abgeleitete Kardiomyozyten einen Bioreaktor mit. Darüber hinaus haben wir dieses Protokoll für HPSC Linien optimiert nicht frei und / oder einzelne Zellkultur, wie neu gegründeten hiPSCs oder großen Kohorten von HPSC Linien relevant Analyse von Krankheitsmechanismus Zubringer angepasst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kardiomyozyten aus hPSCs abgeleitet sind eine äußerst attraktive Quelle für den Einsatz in der menschlichen Krankheit Modellierung, Wirkstoff-Screening / Toxizitätstests und vielleicht in der Zukunft, regenerative Therapien. Eine der Haupthürden, um diese Zellen jedoch verwendet wird, ist die Fähigkeit, genug hochwertigem Material für ihre wirksame Verwendung zur Verfügung zu stellen. Mit unserem beschriebenen Protokoll, bieten wir eine Methode, die diese Beschränkung überwindet.
V…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Materials
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
Referências
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