मानव स्टेम कोशिकाओं से cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत छोटे अणु आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग
Summary
Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Abstract
मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) अनुसंधान, रोग मॉडलिंग, दवा और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए के लाभ को अधिकतम cardiomyocytes सहित कार्यात्मक सेल प्रकार के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए मजबूत तरीकों की आवश्यकता है। यहाँ हम दिखाना है कि WNT, TGF-β, और श के अस्थायी हेरफेर रास्ते संकेतन दोनों स्थिर निलंबन और हड़कंप मच गया निलंबन बायोरिएक्टर प्रणाली में एकल कोशिका की अत्यधिक कुशल cardiomyocyte भेदभाव passaged hPSC लाइनों की ओर जाता है। यह रणनीति काम ~ 100% की धड़कन spheroids के परिणामस्वरूप, लगातार संस्कृति के 15 दिनों के बाद> 80% हृदय ट्रोपोनिन टी पॉजिटिव कोशिकाओं, कई hPSC लाइनों में मान्य हैं। हम यह भी सेल लाइनों वर्तमान में एकल कोशिका passaging, सफलता, जिनमें से 42 hPSC लाइनों में सत्यापित किया गया है के लिए अनुकूल नहीं के साथ प्रयोग के लिए इस प्रोटोकॉल के विभिन्नता पर रिपोर्ट। इन प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न cardiomyocytes वंश विशेष मार्करों और शो की उम्मीद व्यक्त करते electrophysiological कार्यक्षमताओं। हमारी प्रोटोकॉल मानव cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक सरल, कुशल और मजबूत मंच प्रस्तुत करता है।
Introduction
मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs), मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) सहित तीन भ्रूण रोगाणु परतों 1,2 की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए आत्म नवीकरण और क्षमता की क्षमता है। इन विशेषताओं के कारण, hPSCs नैदानिक अनुप्रयोगों 8 के लिए मानव रोग 3-5, उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता assays 6.7 के लिए मॉडलिंग के लिए रोग-प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं की पीढ़ी और स्केलेबल उत्पादन के लिए एक मूल्यवान और असीमित स्रोत प्रदान करते हैं और संभावित । hPSCs से cardiomyocytes की पीढ़ी प्रासंगिक पशु मॉडल की कमी और / या प्रभावित प्राथमिक ऊतकों की उपलब्धता के कारण विशेष रूप से जटिल मानव हृदय रोगों के तंत्र और उनके उपचार संभव है, पहले अपनी क्षमताओं के दायरे से बाहर की जांच करने का अवसर प्रदान करता है।
hPSCs n के ऊपर उल्लिखित आवेदन के सभीअत्यधिक समृद्ध और कार्यात्मक cardiomyocytes की भारी संख्या के उत्पादन ecessitate। इस प्रकार, की उपलब्धता एक कुशल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और कई hPSC लाइनों के लिए इन विट्रो हृदय भेदभाव प्रोटोकॉल में स्केलेबल उपयुक्त महत्वपूर्ण है। परम्परागत cardiomyocyte भेदभाव प्रोटोकॉल ऐसे embryoid शरीर गठन 9, सह संस्कृति तकनीक 10, प्रेरण 11 साइटोकिन्स और प्रोटीन पारगमन तरीकों 12 के कॉकटेल के साथ ही विभिन्न रणनीतियों कार्यरत है। इन तकनीकों के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, अधिकांश अभी भी, गरीब दक्षता से ग्रस्त महंगा विकास के कारकों की आवश्यकता होती है, या सीमित सार्वभौमिकता की पेशकश करते हैं जब कई hPSC लाइनों का उपयोग करने का प्रयास। तिथि करने के लिए, इन चुनौतियों पशु मॉडल में सेल थेरेपी की पढ़ाई के लिए hPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes के उत्पादन के लिए सीमा है, साथ ही में दवाओं की खोज 13 के लिए दवा उद्योग की स्थापना की है। इसलिए, बड़े के लिए मजबूत और सस्ती तकनीक का विकासस्केलेबल संस्कृति प्रणालियों में कार्यात्मक hPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes के -scale उत्पादन काफी हद तक उनके व्यावसायिक और नैदानिक अनुप्रयोगों की सुविधा होगी।
इस पांडुलिपि में, हम उच्च प्रभावकारिता, reproducibility और hESCs और hiPSCs स्रोतों और अत्यधिक के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक विधि सहित संस्कृति तरीकों की एक किस्म से उत्पन्न करने के लिए प्रयोज्यता के साथ एक लागत प्रभावी और एकीकृत हृदय भेदभाव प्रणाली के विकास के लिए रिपोर्ट एक बायोरिएक्टर का उपयोग कर hPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes के समृद्ध आबादी। इसके अतिरिक्त, हम स्वतंत्र और / या एकल कोशिका संस्कृति फीडर के लिए अनुकूल नहीं hPSC लाइनों, इस तरह के नव स्थापित hiPSCs या रोग तंत्र के विश्लेषण के लिए प्रासंगिक hPSC लाइनों की बड़ी साथियों के रूप में के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
hPSCs से निकाली गई cardiomyocytes, पुनर्योजी उपचारों शायद भविष्य में मानव रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग / विषाक्तता परीक्षण में इस्तेमाल के लिए एक अत्यंत आकर्षक स्रोत हैं और। हालांकि इन कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Materials
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
Referências
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
- Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
- Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
- Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
- Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
- Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
- Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
- Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
- Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
- Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
- Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
- McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
- Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
- Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
- Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).
