Summary

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Published: July 25, 2016
doi:

Summary

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Abstract

Maximizar el beneficio de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para la investigación, la modelización de enfermedades, farmacéuticos y aplicaciones clínicas requiere métodos robustos para la producción a gran escala de tipos de células funcionales, incluyendo los cardiomiocitos. Aquí demostramos que la manipulación temporal de WNT, TGF-β, y SHH vías de señalización conduce a líneas HPSC diferenciación de cardiomiocitos altamente eficiente de una sola célula a pases en tanto la suspensión estática y sistemas de suspensión de biorreactores agitados. El empleo de esta estrategia resultó en ~ 100% superando esferoides, que contiene consistentemente> 80% de células T positivos de troponina cardiaca después de 15 días de cultivo, validados en múltiples líneas HPSC. También informamos sobre una variación de este protocolo para su uso con líneas celulares no está adaptado a los pases de una sola célula, cuyo éxito ha sido verificado en 42 líneas HPSC. Cardiomiocitos generados usando estos protocolos expresan marcadores específicos de linaje y espera mostrar electrophysIOLÓGICA funcionalidades. Nuestro protocolo presenta una plataforma simple, eficiente y robusto para la producción a gran escala de los cardiomiocitos humanos.

Introduction

Las células humanas pluripotentes madre (hPSCs), incluyendo las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), tienen la capacidad de auto-renovación y la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias 1,2. Debido a estas características, hPSCs proporcionan una fuente valiosa e ilimitado para la generación y escalable de producción de tipos de células relevantes de la enfermedad para el modelado de la enfermedad humana 3-5, para la detección de drogas y de toxicidad ensayos de alto rendimiento 6,7 y potencialmente para aplicaciones clínicas 8 . Generación de los cardiomiocitos de hPSCs ofrece la oportunidad de investigar específicamente los mecanismos de las enfermedades cardiovasculares humanos complejos y sus posibles tratamientos, anteriormente más allá del alcance de nuestra capacidad debido a la falta de modelos animales relevantes y / o la disponibilidad de tejidos primarios afectados.

Todas las aplicaciones mencionadas anteriormente de hPSCs necessitate la producción de un número masivo de los cardiomiocitos altamente enriquecidos y funcionales. Por lo tanto, la disponibilidad de un servicio eficaz, reproducible y escalable in vitro protocolo de diferenciación cardiaca adecuado para múltiples líneas HPSC es crucial. Protocolos de diferenciación de los cardiomiocitos convencionales han empleado diferentes estrategias como la formación de cuerpos embrioides 9, 10 técnicas de co-cultivo, la inducción con un cóctel de citoquinas 11 y métodos de transducción de la proteína 12. A pesar de los avances en estas técnicas, la mayoría todavía sufren de una pobre eficiencia, requieren factores de crecimiento caros, u ofrecer universalidad limitada cuando se trata de utilizar varias líneas HPSC. Hasta la fecha, estos problemas han establecido límites a la producción de los cardiomiocitos derivados de HPSC para los estudios de terapia celular en modelos animales, así como en la industria farmacéutica para el descubrimiento de fármacos 13. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas robustas y asequibles para grandes-scale la producción de cardiomiocitos funcionales derivados de HPSC en sistemas de cultivo escalables facilitaría en gran medida sus aplicaciones comerciales y clínicos.

En este manuscrito, se presenta el desarrollo de un sistema de diferenciación cardiaca rentable e integrada con una alta eficacia, reproducibilidad y aplicabilidad a hESCs y hiPSCs generados a partir de una variedad de fuentes y métodos de cultivo, incluyendo un método para la producción a gran escala de muy poblaciones enriquecidas de cardiomiocitos derivados de HPSC utilizando un biorreactor. Además, hemos optimizado este protocolo para las líneas HPSC no adaptados al alimentador de cultivo celular libre y / o individual, como hiPSCs de nueva creación o grandes cohortes de líneas HPSC pertinentes para el análisis del mecanismo de la enfermedad.

Protocol

1. Preparación de medios de cultivo, revestimiento de placas de cultivo celular y Mantenimiento de indiferenciado hPSCs Preparación de medios Nota: Esterilizar los medios de comunicación que utilizan un dispositivo de 0,22 micras filtración y se almacena a 4 ° C protegido de la luz para un máximo de 4 semanas. Nombres de reactivos, los proveedores y los números de catálogo se enumeran en la Tabla de Materiales. Para fibroblastos embrio…

Representative Results

Con el fin de establecer un método simple para la diferenciación a gran escala de los cardiomiocitos de hPSCs, hemos creado un protocolo en el cual se trataron las células inicialmente con un activador de WNT / β-catenina (CHIR99021) 16 y, posteriormente, con inhibidores de la Wnt / β- catenina y factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) vías (IWP2 16 y SB431542 17, respectivamente) y, finalmente, un activador de la proteína sonic hedgehog (S…

Discussion

Los cardiomiocitos derivados de hPSCs son una fuente extremadamente atractivo para su uso en el modelado de la enfermedad humana, la detección de pruebas de drogas / toxicidad y, quizás en el futuro, las terapias regenerativas. Uno de los principales obstáculos para el uso de estas células, sin embargo, es la capacidad para proporcionar suficiente material de alta calidad para su uso efectivo. Utilizando nuestro protocolo descrito, ofrecemos un método que supera esta limitación.

Recien…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.

Materials

Knockout DMEM Life Technologies 10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR) Life Technologies 10828028
Glutamax Life Technologies 35050061
MEM Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Miltenyi Biotec 130-093-843
RPMI1640 Life Technologies 11875093
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190144
DPBS Life Technologies 14287072
Attachment Factor (AF) Life Technologies S006100
ECM Gel Sigma-Aldrich E1270
Laminin Invitrogen 23017-015
DMEM Life Technologies 11965-092                                                                                                       
Fatal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071
B27 minus insulin Gibco A18956-01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063
0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
Collagenase Type IV Life Technologies 17140-019
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C7902
Mitomycin C Bioaustralis BIA-M1183
CHIR99021 Miltenyi Biotec 130-104-172
IWP2 Miltenyi Biotec 130-105-335
SB431542 Miltenyi Biotec 130-095-561
Purmorphamine Miltenyi Biotec 130-104-465
ROCK inhibitor Y-27632 Miltenyi Biotec 130-104-169
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Poly Vinyl Alcohol (PVA) Sigma-Aldrich 363073
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Trypan Blue Bio-Rad 145-0013
Accumax  Innovative Cell Technologies Inc. AM105
Sigmacote  Sigma-Aldrich SL2 
CELLSPIN Integra Biosciences 183 001
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml  Integra Biosciences 182 023
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Prepared in-house (or commercially available)
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines Prepared in-house (or commercially available)

Referências

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
  4. Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
  5. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
  6. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  7. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
  8. Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
  9. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
  10. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
  13. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
  14. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
  15. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
  16. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
  17. Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
  18. Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
  19. Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
  20. Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
  21. Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
  22. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
  23. Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
  24. Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
  25. McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
  26. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
  27. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  28. Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
  29. Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
  30. Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
  31. Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
  32. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
  33. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
  34. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).
check_url/pt/54276?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Fonoudi, H., Ansari, H., Abbasalizadeh, S., Blue, G. M., Aghdami, N., Winlaw, D. S., Harvey, R. P., Bosman, A., Baharvand, H. Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol. J. Vis. Exp. (113), e54276, doi:10.3791/54276 (2016).

View Video