Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Maximera nyttan av humana pluripotenta stamceller (hPSCs) för forskning, sjukdom modellering, farmaceutiska och kliniska tillämpningar kräver robusta metoder för storskalig produktion av funktionella celltyper, inklusive cardiomyocytes. Här visar vi att den tidsmässiga manipulation av WNT, TGF-β, och SHH signalvägar leder till effektiv cardiomyocyte differentiering av encelliga passe hPSC linjer i både statiska suspensionen och omrörd suspension bioreaktorsystem. Att använda denna strategi resulterade i ~ 100% slå sfäroider konsekvent innehållande> 80% kardiellt troponin T-positiva celler efter 15 dagars odling, validerade i flera hPSC linjer. Vi rapporterar också om en variant av detta protokoll för användning med cellinjer för närvarande inte anpassade till encelliga passage, vars framgång har verifierats i 42 hPSC linjer. Kardiomyocyter som genereras med hjälp av dessa protokoll uttrycker härstamning specifika markörer och visa förväntas electrophysiological funktionaliteter. Vår protokoll presenterar en enkel, effektiv och robust plattform för storskalig produktion av mänskliga hjärtmuskelceller.
Humana pluripotenta stamceller (hPSCs), inklusive mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), har förmågan till självförnyelse och förmåga att differentiera till celler av de tre embryonala groddblad 1,2. På grund av dessa egenskaper, hPSCs ger en värdefull och obegränsad källa för generering och skalbar produktion av sjukdomsrelevanta celltyper för att modellera den mänskliga sjukdomen 3-5, för hög genomströmning drogscreening och toxicitetsanalyser 6,7 och potentiellt för kliniska tillämpningar 8 . Generation av kardiomyocyter från hPSCs ger möjlighet att specifikt undersöka mekanismerna för komplexa mänskliga hjärt-kärlsjukdomar och deras möjliga behandlingar, tidigare utanför ramen för vår förmåga på grund av bristen på relevanta djurmodeller och / eller tillgången till drabbade primära vävnader.
Alla de ovan nämnda tillämpningarna av hPSCs necessitate produktionen av massiva mängder av höganrikat och funktionella hjärtmuskelceller. Således, en effektiv, reproducerbar och skalbar in vitro hjärt differentiering protokoll som lämpar sig för flera hPSC linjer är avgörande att det finns. Konventionella cardiomyocyte differentiering protokoll har använt olika strategier såsom embryoid kropp bildning 9, co-odlingstekniker 10, induktion med cocktails av cytokiner 11 och protein överföringsmetoder 12. Trots framsteg inom dessa tekniker, de flesta fortfarande lider av dålig effektivitet, kräver dyra tillväxtfaktorer, eller erbjuder begränsad universalitet när du försöker använda flera hPSC linjer. Hittills har dessa utmaningar sätta gränser för produktionen av hPSC-härledda kardiomyocyter för cellterapi studier i djurmodeller, samt inom läkemedelsindustrin för läkemedelsutveckling 13. Därför är utvecklingen av robusta och prisvärda tekniker för stor-Scale produktion av funktionella hPSC-härledda kardiomyocyter i skal odlingssystem skulle i hög grad underlätta deras kommersiella och kliniska tillämpningar.
I detta manuskript, rapporterar vi utvecklingen av en kostnadseffektiv och integrerad hjärtdifferentieringssystem med hög effektivitet, reproducerbarhet och tillämpbarhet till hESCs och hiPSCs genereras från en mängd olika källor och odlingsmetoder, bland annat en metod för storskalig produktion av högt anrikade populationer av hPSC-härledda kardiomyocyter med användning av en bioreaktor. Dessutom har vi optimerat detta protokoll för hPSC linjer som inte är anpassade till feeder fri och / eller enkelcellkultur, såsom nybildade hiPSCs eller stora kohorter av hPSC linjer som är relevanta för analys av sjukdomsmekanismen.
Kardiomyocyter härledda från hPSCs är en mycket attraktiv källa för användning i mänsklig modellering sjukdom, screening test drog / toxicitet och, kanske i framtiden, regenerativ behandlingar. En av de stora hindren för att använda dessa celler är emellertid förmågan att ge tillräckligt material av hög kvalitet för deras effektiva användning. Med vår beskrivna protokollet, erbjuder vi en metod som övervinner denna begränsning.
Nyligen har syntetiska små molekyler riktade…
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |