Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları
Summary
Bu protokol gap junction kanalları aracılığıyla arası iletişimi ölçen bir neşter yükleme-floresan boya aktarımı teknik anlatılmaktadır. Gap Junctional hücrelerarası iletişim doku homeostazı korunur ve bu hücre sinyal bozulması olumsuz sağlık etkileri vardır edildiği önemli bir hücresel bir süreçtir.
Abstract
Bu protokol, doku homeostazı muhafaza edildiği bir önemli arası bir süreçtir gap junction kanalları aracılığıyla arası iletişimi ölçen bir neşter yükleme-floresan boya transferi (SL-DT) tekniği açıklar. Vb toksik maddelerin, toksinler, ilaçlar, tarafından boşluk junctional arası iletişim (GJIC) kesilmesi çok olumsuz sağlık etkileri ile bağlantılı olmuştur. Birçok genetik temelli insan hastalıkları gap junction genlerdeki mutasyonlarla bağlantılı olmuştur. SL-DT tekniği hücrelerinin geniş bir popülasyonda GJIC eşzamanlı değerlendirilmesi için basit bir işlevsel tahlildir. Deney kısa hücre popülasyonu ile bir neşter ile hücre zarı bozucu bir floresan boya ile ön yükleme hücreleri içerir. floresan boya sonra belirlenmiş bir süre için hücreler komşu gap junction kanalları aracılığıyla çapraz izin verilir. Bundan sonra, tahlil hücrelere formalin ilavesi ile sona erdirilir. fluo yayılmasıhücre popülasyonu ile rescent boya Epifloresans mikroskop ile değerlendirilir ve görüntüler kamu malı bulunan ücretsiz yazılım paketleri de dahil olmak üzere mevcut morfometrik yazılım paketleri, herhangi bir sayı ile analiz edilir. Bu deney, aynı zamanda tedavi edilen hayvanlardan elde edilen çeşitli organlarda doku dilimleri kullanılarak in vivo çalışmalar için adapte edilmiştir. Genel olarak, SL-DT deneyi in vitro farmakolojik ve toksikolojik ihtiyaçlarını geniş bir hizmet edebilir, ve potansiyel olarak daha kısa bir süre içinde daha fazla örnek aydınlatmak için otomatik floresans mikroskobu görüntüleme ve analiz ile yüksek verim kurulum sistemleri için adapte edilebilir.
Introduction
Bu yöntem genel amacı, bileşiklerin potansiyel toksisite değerlendirmek için basit, kapsamlı ve nispeten ucuz bir teknik sunmaktır. Bu, birden fazla hücre hatlarında kullanılan bir in vitro bir yaklaşımdır. Epifloresans mikroskopları ile donatılmış standart hücre biyoloji laboratuarları bu testi kullanılarak araştırma yapabilir.
Hücre fonksiyonlarının temel bilgi, in vitro biyoanalizlere son derece bağımlı olmuştur ve ilaç, çevresel kirleticiler ve gıda doğan kirleticilerin toksikolojik değerlendirmeler önemli bir bileşeni haline gelmiştir. Ne yazık ki, kapsamlı, tüm toksikolojik değerlendirmeler için taleplerini karşılayacak tek in vitro biyoassay sistemi vardır. In vitro deneyler birçok tasarlanmış ve değerlendirmek ve aynı zamanda özel bir biyokimyasal ve moleküler uç noktasını değerlendirmek için optimize edilmiştir. Bunlar oldukça sık bir bir pertürbasyon yansıtmak için kurulmuş bir yüksek verimlilik birleştirilirBu östrojen reseptörü 1 sinyal belirli bir sinyal iletim yolu,. Bu strateji çok başarılı olmuştur, ama gen sentezlenmesine katılan sinyal transdüksiyon yollarının fazla sayıda oldukça karmaşık değerlendirmek için özel bir sinyal yolunu seçmek görevi yapar. Yüksek verimlilikte bir protokoller şu anda geliştirilen ve aynı anda tek tahlillerin bazı zayıf taraflarını bertaraf etmek bir yaklaşım olmuştur sayısız sinyal yolları, ölçmek için kullanılmaktadır. Ancak, tüm sinyal yolları başarıyla daha kapsamlı yaklaşımlar içine dahil edilmiştir, artı yeni sinyal yolları sürekli ileri daha karmaşık hale getirmektedir bu değerlendirme sürecini tespit edilmektedir. Özellikle yüksek verimlilikte bir sistemlerde, in vitro yaklaşımların geniş numaralarını kullanarak, kapsamlı toksikolojik değerlendirmeler de çok pahalı ve en tek araştırmacı için elverişli değildir için araştırma projeleri yürüttü.
GJIC bir işlem tıg olduğuhtly zarı ve hücre iskeletinin proteinleri 2,3 ile önemli hücre içi sinyal iletim yolları ve etkileşimler tarafından düzenlenir voltaj değişiklikleri, kalsiyum konsantrasyonu, pH, redoks dengesinin tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, GJIC inhibisyonu farklı hücresel stres tipleri, farklı hücresel fonksiyonları kesintiye uğraması ya da farklı sinyal iletim yollarının düzensizlikler yansıtabilir. Sınırlı sinyal iletim biyoanalizlere kullanımını aşmak için başka bir yaklaşım değil, en takdirde, sinyal iletim yolları daha gap junction kanalları 4-8 ile kooperatif arası sinyalizasyon sistemleri tarafından pek modüle edilir biyolojik olayların yararlanmak etmektir. arası sinyal sistemleri de çok sayıda ve çok yolu kontrolü altında olmakla birlikte, boşluk birleşim kanallardan arası sinyal sonuçta kısmen kapalı ya da tamamen kapalı açılan kanalların bir fonksiyonudur. Bu kolayca çeşitli kullanılarak ölçülebilir bir bitiş noktası sağlarnitro biyo-tahlil sistemlerinde 7. Bir doku homeostatik ayar noktası boşluk junctional içi iletişim bileşiklerin etkisini belirleyen, açık kanallar gerektirdiğini düşünürsek (GJIC) bileşiklerin 4,8 potansiyel toksik etkileri belirlemede daha kapsamlı bir yaklaşımdır. Esas olarak, gen ekspresyonunu kontrol çoklu sinyal transdüksiyon olayları koordine merkezi bir rol oynamaktadır, bu kritik bir biyolojik fenomen toksik etkileri geniş bir değerlendirmesi için olanak sağlar. Böylece, GJIC değerlendirmek biyo-bileşiklerin toksik potansiyelini değerlendirmek için mükemmel bir başlangıç noktasıdır.
GJIC değerlendirmek için kullanılan en geniş teknikler floresan prob hücreleri ön yükleme ve daha sonra komşu hücrelere yüklenen hücre veya hücrelerden boya geçişini takip dayanmaktadır. Boya önyükleneceği Teknikleri prob 11 yükleme 10, ve metil esterleri kazıyın, mikroenjeksiyon 9 yer var </sus>. Neşter yükleme-floresan boya transferi (SL-DT) yöntemi kazıma yükünün bir değişiklik – El Fouly 10 tarafından geliştirilen aktarım deneyi boya. Aksine daha invaziv scrape daha bu raporun neşter yükleme yöntemi invaziv zararı en aza indirmek hücreleri (Şekil 1) bir tek tabaka ile yuvarlak bıçak ile bir neşter hafif bir rulo içerir. Bu tekniğin avantajları hücreleri yerine mikroenjeksiyon tahlilinin tek hücrelerden oluşan bir popülasyonun toksikolojik değerlendirilmesi bulunmaktadır. Mikroenjeksiyon teknikleri ve fluoresan problar metil esterlerini kullanmak teknikler kullanılarak yöntemleri çok daha fazla zaman alıcı ve önemli ölçüde daha yüksek yetenek ihtiyacı olmasına rağmen Ayrıca, bu deneyde basitliği, kısa sürede çok sayıda levha hızlı tespiti için verir.
GJIC okuyan tüm ihtiyaçlarını karşılamak için tek bir yöntem olsa da; SL-DT tahlil o can, basit, oldukça ucuz ve çok yönlü bir testtirÇeşitli bileşiklerin toksisite ilk değerlendirmeler için birçok ihtiyaçlarını karşılamak. Önemli avantajları şunlardır: basitlik, (sıkı bağlamak) deneyi ve moleküler flüoresan prob deneyleri, büyük içinde GJIC arasında hızlı ve aynı anda değerlendirme lokal aktifleştirilmesi ile ışıkla ağartma sonra mikroenjeksiyon, floresan kurtarma gibi diğer yöntemler için gerekli olan ekipman veya beceri için özel bir ihtiyacı in vivo çalışmalar için otomatik floresans mikroskobu görüntüleme ve analiz, hem de kendi ile uyumlu olan bu yüksek işleme kapasiteli bir kurulumu için elverişli hücrelerin sayısı.
Protocol
Representative Results
Discussion
SL-DT tahlil GJIC ölçmek basit ve çok yönlü bir tekniktir, ancak uygun deneysel protokolleri tasarlama göz önüne alınmalıdır birçok kritik endişeler vardır. SL-DT tahlili kullanılarak GJIC sağlam ölçümler için hücrelerin gap junction aracılığıyla LY iyi bir boya yayılmış olması gerekir. En azından, uygun bir zaman boya her iki yönde de neşter yüklü hücrelerden hücre sekiz ya da daha fazla sıra yayılır sağlamak için seçilmelidir. Ayrıca, boya neşter yüklü hücrelerin göç me…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIEHS grants #R01 ES013268-01A2, and the contents are solely the responsibility of the author and do not necessarily represent the official views of the NIEHS, and supported by CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
Materials
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3819–01 | |
| KH2PO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker – Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 mL conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system. | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| Image J | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Referências
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C., Travis, C. C. . Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. , 165-179 (1989).
- Trosko, J. E., Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. . Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. , 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H., Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. , 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. r. o. s. k. o., Dittmar, T., Zaenkar, K. . Stem Cells and Cancer. , 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
