Brecha ocasiones intercelular de comunicación: un biomarcador funcional para evaluar los efectos adversos de las sustancias tóxicas y toxinas, y de Salud Beneficios de Productos Naturales
Summary
Este protocolo describe una técnica de transferencia de carga de tintes fluorescentes bisturí que mide la comunicación intercelular a través de canales brecha de la salida. Brecha de comunicación intercelular de la unión es un proceso celular importante mediante el cual se mantiene la homeostasis del tejido y la interrupción de esta señalización celular tiene efectos adversos para la salud.
Abstract
Este protocolo describe un bisturí de carga fluorescente de transferencia de colorante técnica (SL-DT) que mide la comunicación intercelular a través de canales de salida brecha, que es un proceso intercelular importante por el cual se mantiene la homeostasis del tejido. La interrupción de la unión brecha de comunicación intercelular (GJIC) por agentes tóxicos, toxinas, drogas, etc. se ha relacionado con numerosos efectos adversos para la salud. Muchas enfermedades humanas basadas en la genética se han relacionado con mutaciones en genes brecha de la salida. La técnica de SL-DT es un ensayo funcional simple para la evaluación simultánea de GJIC en una gran población de células. El ensayo implica las células pre-carga con un colorante fluorescente perturbando brevemente la membrana celular con una hoja de bisturí a través de una población de células. Se deja entonces que el colorante fluorescente para atravesar a través de canales de unión brecha a las células vecinas para un tiempo designado. El ensayo se termina entonces por adición de formalina a las células. La propagación de la fluorescent tinte a través de una población de células se evaluó con un microscopio de epifluorescencia y las imágenes se analizaron con cualquier número de paquetes de software que están disponibles morfométricas, incluyendo paquetes de software libre que se encuentran en el dominio público. Este ensayo también se ha adaptado para estudios in vivo utilizando rodajas de tejido de diferentes órganos de animales tratados. En general, el ensayo de SL-DT puede servir a una amplia gama de necesidades farmacológicas y toxicológicas in vitro, y puede ser potencialmente adaptada para sistemas de configuración de alto rendimiento con fluorescencia automatizado de imágenes y análisis de microscopía para dilucidar más muestras en un tiempo más corto.
Introduction
El objetivo general de este método es proporcionar una técnica sencilla, completa y relativamente barato para evaluar la toxicidad potencial de los compuestos. Este es un enfoque in vitro que puede ser utilizado en múltiples líneas celulares. laboratorios de biología celular estándar equipadas con microscopios de epifluorescencia pueden conducir búsquedas utilizando este ensayo.
Nuestro conocimiento básico de las funciones celulares ha sido dependiente de bioensayos in vitro altamente, y se ha convertido en un componente esencial en las evaluaciones toxicológicas de los productos farmacéuticos, los contaminantes ambientales y contaminantes de los alimentos nacido. Desafortunadamente, no existe un único sistema de bioensayo in vitro que puede satisfacer integralmente las demandas de todas las evaluaciones toxicológicas. Muchos ensayos in vitro están diseñados y optimizados para evaluar, así como evaluar un criterio de valoración bioquímica o molecular específico. Estos se combinan muy a menudo en un alto rendimiento creado para reflejar una perturbación de unadeterminada vía de transducción de señales, tales como la señalización del receptor de estrógeno 1. Esta estrategia ha tenido bastante éxito, pero el gran número de vías de transducción de señales implicadas en la expresión de genes que hace que la tarea de elegir una vía de señalización específica para evaluar bastante complejo. Los altos protocolos a través de-puestos están siendo desarrollados y utilizados para medir simultáneamente numerosas vías de señalización, que ha sido un enfoque para superar algunas de las limitaciones de los ensayos individuales actualmente. Sin embargo, no todas las vías de señalización se han incorporado con éxito en enfoques más amplios, además de nuevas vías de señalización están siendo constantemente descubierto que complica aún más este proceso de evaluación. El uso extenso número de enfoques in vitro, particularmente alto rendimiento de procesamiento de sistemas, para las evaluaciones toxicológicas completas también son muy caros y no son propicias para la mayoría solo investigador dirigido proyectos de investigación.
GJIC es un proceso tightly controlado por los cambios en el voltaje, la concentración de calcio, el pH, equilibrio redox, regulados por las principales vías de transducción de señales intracelulares y las interacciones con la membrana y las proteínas del citoesqueleto 2,3. Por lo tanto, la inhibición de GJIC puede reflejar diferentes tipos de estrés celular, la interrupción de las diferentes funciones celulares, o perturbaciones de diferentes vías de transducción de señales. Otro enfoque para superar el uso de bioensayos limitados de transducción de señales es para tomar ventaja de los fenómenos biológicos que muchos, si no la mayoría, las vías de transducción de señales se modulan aún más por los sistemas de señalización intercelular de cooperación a través de canales de unión brecha 4-8. Aunque los sistemas de señalización intercelular también son numerosos y bajo el control de vía múltiple, la señalización intercelular a través de canales de salida brecha es en última instancia una función de los canales de ser abierto, parcialmente cerrada o completamente cerrada. Esto proporciona un punto final que se puede medir fácilmente utilizando diversosen los sistemas de bioensayo in vitro 7. Teniendo en cuenta que el punto de ajuste homeostático de un tejido requiere canales abiertos, para determinar el efecto de los compuestos sobre la brecha ocasiones la comunicación intercelular (GJIC) es un enfoque más amplio para determinar los posibles efectos tóxicos de los compuestos 4,8. En esencia, este fenómeno biológico fundamental que desempeña un papel central en la coordinación de múltiples eventos de transducción de señales que controlan la expresión de genes permite una amplia evaluación de los efectos tóxicos. Por lo tanto, los bioensayos que evalúan la GJIC son un excelente punto de partida para evaluar el potencial tóxico de compuestos.
Los más extensas técnicas utilizadas para evaluar GJIC se basan en la precarga de las células con una sonda fluorescente y luego el control de la migración del colorante de la célula de carga o células a las células adyacentes. Las técnicas para precargar el colorante han implicado microinyección 9, raspar de carga 10, y metil ésteres de las sondas 11 </sup>. La transferencia de colorante de carga fluorescente bisturí método (SL-DT) es una modificación de la carga de raspadura – dye ensayo de transferencia desarrollado por El Fouly 10. En lugar de la raspadura más invasivo, el método de bisturí de carga de este informe implica un rollo suave de un escalpelo con una cuchilla redonda a través de una monocapa de células que reduzcan al mínimo el daño invasiva (Figura 1). Las ventajas de esta técnica son la evaluación toxicológica de una población de células en lugar de células individuales del ensayo de microinyección. Además, la simplicidad de este ensayo permite la detección rápida de múltiples placas en un corto tiempo mientras que los métodos que utilizan técnicas de microinyección y técnicas que usan ésteres metílicos de sondas fluorescentes son que consume mucho más tiempo y requieren considerablemente más alto nivel de habilidad.
Aunque no existe un método único para satisfacer todas las necesidades de estudiar la GJIC; el ensayo SL-DT es un ensayo simple, bastante barato y versátil que puedesatisfacer muchas de las necesidades de las evaluaciones iniciales de la toxicidad de diversos compuestos. Las principales ventajas son: simplicidad, no hay necesidad especial para el equipo o las habilidades que se requieren para otros métodos tales como la microinyección, la recuperación de fluorescencia después de photobleaching ensayo (FRAP) y la activación local de ensayos de sondas fluorescentes moleculares, una evaluación rápida y simultánea de GJIC en un gran número de células, que conduzca a un alto rendimiento de la configuración con fluorescencia automatizado de formación de imágenes de microscopía y análisis, así como su capacidad de adaptación para los estudios in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo SL-DT es una técnica sencilla y versátil en la medición de la GJIC, pero hay varios problemas críticos que deben ser explicados en el diseño de protocolos experimentales apropiados. Para las mediciones robustas de GJIC utilizando el ensayo de SL-DT tiene que haber un tinte de propagación de la LY a través de uniones de las células. Como mínimo, un tiempo adecuado se debe seleccionar para asegurar que el tinte se propaga a través de ocho o más filas de células a partir de las células de bisturí ca…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIEHS grants #R01 ES013268-01A2, and the contents are solely the responsibility of the author and do not necessarily represent the official views of the NIEHS, and supported by CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
Materials
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3819–01 | |
| KH2PO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker – Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 mL conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system. | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| Image J | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Referências
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