הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

Summary

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Abstract

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme’s biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

Introduction

Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)^1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities^3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid⁵ and Nelson-Somogyi⁶ assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly⁷.

We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.

One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods⁷. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability ⁸ and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge ⁸.

The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).

CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.

Protocol

1. Assay chromogenic עם CPH מצעים בתוך פורמט פלייט 96-היטב הפעלת הצלחת ערכת assay הפעל את מסנן 96-היטב (המכיל כחול CPH-xylan) צלחת ערכת assay (רשימת חומרים) על ידי הוספת פתרון הפעלת 200 μl (שהושג עם הערכה) לתוך כל טוב, ואחריו דגירת 10 דקות בטמפרטורת חדר ללא תסיסה. החל ואקום באמצעות סעפת ואקום (עם בלוק spacer בתוך וכל סטנדרט, צלחת 96-היטב שקופה כמו צלחת אוסף) להסיר פתרון הפעלה קיים. כמו כן ניתן להשתמש צנטריפוגות ב 2,700 XG במשך 10 דקות עבור שלב זה במקום סעפת ואקום. שטפו את מצעי CPH ידי הוספת מים 100 μl סטרילי ולהחיל ואקום (או כוח צנטריפוגלי) להסיר את מייצב. חזור על פעולה זו עוד פעמיים, והלוחות כעת מוכן לשימוש. תגובת אנזים הערה: תמיד כוללים חיץלבד כביקורת שלילית ואם אנזימים אפשריים מאופיינים בעבר שולט חיובי. השתמש במספר סטטיסטי מתאים של משכפל. מצעי CPH יציבים בין pH 3.0 כדי 10.0 ו הנפח הכולל של פתרון אנזים סוף החיץ היטב כל אחד לא יעלה על 180 μl. תמצית צמח או מרק התרבות יכולה לשמש גם במקום פתרון אנזים מטוהר. להוסיף 150 μl 100 מ"מ חיץ נתרן אצטט, pH 4.5 ו -5 פתרון -cellulase אנדו μl (לריכוז סופי של 1 U / ml) היטב בכל צלחת ערכת assay. מכניס את צלחת המוצר (צלחת ברורה היטב תואמת לקורא microtiter הצלחת) מתחת לצלחת ערכת assay לאסוף כל דליפה פוטנציאל מצלחת התגובה במהלך רועד. דגירה את הצלחת ערכת assay של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתוך שייקר אופקי ב 150 סל"ד. הערה: ערבוב התגובה בצלחת ערכת assay במהלך הדגירה היא קריטית להשגה עקבית reproתוצאת ducible. מצעי CPH יציבים עד 90 מעלות צלזיוס. זמן הדגירה צריך להיות מוגבר עד 24 שעות כאשר בודקים broths התרבות המכיל ריכוז אנזים ידוע עם מצעי CPH. שים לב פעמי דגירה מתאימות תלוי בפעילות של האנזים (ים), אך באופן כללי אם אין פעילות לזיהוי תוך 24 שעות, סביר להניח כי האנזים לא לבזות את המצע נבדק. אנזים פעיל משפיל סוכרי chromogenic המסיסים של מצע CPH לתוך אוליגוסכרידים chromogenic מסיסים, אשר גלויים כמו supernatant בצבע. מניח את הצלחת המוצר הנקיה בתוך סעפת הוואקום עם בלוק spacer בפנים. מניחים את הצלחת ערכת assay על גבי ולהחיל ואקום (לחץ שלילי המרבי של -60 kPa). כמו כן ניתן להשתמש צנטריפוגות ב 2,700 XG במשך 10 דקות. הערה: התסנין המכיל את אוליגוסכרידים בצבע כמוצר תגובה הוא עכשיו בצלחת המוצר לניתוח נוסף 8 </sעד>. איתור וכימות בדוק כי נפח הנוזל בכל טוב של צלחת המוצר הוא בערך אותו הדבר על ידי בדיקה ויזואלית. קראו את הספיגה של צלחת האוסף ב 595 ננומטר עבור CPH-xylan הכחול באמצעות קורא צלחת. כאשר עושים ניתוח נתונים, לחסר למאגר בלבד ערכי ביקורת השליליים מן הערכים המבארים שבו אנזים נוסף. חשב את הערך הממוצע ואת סטיית התקן של אמצעי (SEM) מבארות לשכפל 8. 2. Assay chromogenic עם מצעים ICB בתוך פורמט 96-היטב תגובת אנזים להוסיף למאגר נתרן אצטט 150 μl 100 מ"מ, pH 4.5 ו -5 μl 31 U / ml אנדו -xylanase פתרון היטב בכל צלחת ערכת assay המכיל קש ICB-חיטה אדומה (ריכוז האנזים האחרון הבאר: מ"ל 1 U /) . הערה: צלחות ערכת assay (96-גם מסנן plאטס המכיל מצעי ICB) מיוצר כפי שתואר בספרות (ראה רשימה של חומרים). מצעי ICB יציבים מאגרים עם טווח ה- pH בין pH 3.0 כדי 10.0. תמיד כוללים חיץ לבד כביקורת שלילית, אנזימים מסחריים כביקורת חיובית ולהשתמש מספר מתאים סטטיסטי של העתקים. אין להפעיל את מצעי ICB כמו צלחת מצע CPH, אבל להסיר את המייצב ידי שטיפת שלוש פעמים עם 100 μl מים ואחריו סינון ואקום או צנטריפוגה. מכניסים את הצלחת המוצר מתחת לצלחת המצע לאסוף כל דליפה פוטנציאל מהצלחת המצע במהלך רועד. דגירת התגובה על 25 מעלות צלזיוס הרועדת ב 150 סל"ד במשך שעה 2. הערה: אנזים פעיל משפיל סוכרי chromogenic המסיסים מצע ICB לתוך אוליגוסכרידים מסיסים, אשר גלויים כמו supernatant בצבע. מצעי ICB יציבים עד 90 מעלות צלזיוס. הדגירה tIME צריכה להיות מוגברת עד 24 שעות אם אנזימים שאינם מטוהרים כגון broths התרבות משמשים. מניחים את הצלחת המוצר בתוך סעפת ואקום עם בלוק spacer בפנים. מניחים את הצלחת ערכת assay על גבי ולהחיל ואקום (לחץ שלילי המרבי של -60 kPa) או להשתמש צנטריפוגות כדי תסנין המוצר מהצלחת ערכת assay לתוך הבאר של צלחת המוצר. הערה: התסנין המכיל את אוליגוסכרידים בצבע כמוצר תגובה הוא עכשיו בצלחת האוסף לניתוח נוסף 8. איתור וכימות בדוק כי נפח הנוזל בכל טוב של צלחת האוסף הוא בערך אותו הדבר על ידי בדיקה ויזואלית. קראו את הספיגה של צלחת האוסף ב 517 ננומטר עבור קש אדום ICB-חיטה באמצעות קורא צלחת. כאשר עושה ניתוח נתונים – לחסר למאגר – ערכי שליטה שליליים רק מן הערכים המבארים שבו אנזיםהוסף. חשב את הערך הממוצע ואת סטיית התקן של אמצעי (SEM) מבארות לשכפל 8. הערה: במקרה של הקרנת אנזימים ידועים, אנו מציעים לבצע סדרת דילול על מנת לקבל נתונים מפורטים יותר על הטווח הדינמי של פעילות האנזים.

Representative Results

ההיי-התפוקה וקיבולת ריבוב של assay זה מבוסס על פולימר מסיס chromogenic (או חלבון) הידרוג'ל (CPH) מצעים מסודרים צלחות מסננות 96-היטב. אנזימים וכן שולטת שלילי מתווספים צלחת ערכת assay (איור 1 א) ו אנזימים לבזות את המצע המקביל הפקת supernatant בצבע (איור 1B). לאחר התגובה נגמרה, supernatant מועבר לתוך צלחת מוצר ברור היטב את הספיגה ניתן למדוד ישירות באמצעות ספקטרופוטומטר מתאים צלחות 96-היטב (איור 1 ג). דוגמא לתגובת מנה של CPH-arabinoxylan כדי xylanase בריכוזים שונים של האנזים (0.00 – 0.75 U / ml) מוצגת באיור 1D שבו ריכוז האנזים היורד ניתן לראות בצורה ויזואלית. קוואנט spectrophotometric מפורט יותרification ניתן להשתמש כדי לתכנן את ספיגת לעומת ריכוז האנזים (איור 1E). עוצמת האות תואמת את פעילות האנזים. השחזור של assay מוצג על ידי מוטות השגיאה (סטיית התקן של ממוצע, SEM, של שלושה העתקים). עוד ניסויים מפורטים על השחזור של assay זה מתפרסמים במקום אחר 8. איור 1. טיפול xylanase של CPH-arabinoxylan. א) תוכנית של הצלחת ערכת assay עם המצע CPH (למשל, CPH-arabinoxylan) נטען לתוך בארות צלחת מסנן 96-גם ממש לפני תוספת של אנזימים 1 ו -2 ו למאגר שליטה מהודרת (אנזים 1 היה פעילות -xylanase אנדו); B) ביזוי של CPH-arabinoxylan ידי אנזים 1 פיק supernatant בצבע; C) עם filtrat ואקום בסיועיון של supernatants ב לצלחת המוצר, את ספיגת נמדדת spectrophotometrically; D) צלחת מוצר המכיל את תוצרי התגובה לאחר טיפול של arabinoxylan CPH ב 4 צבעים שונים עם ריכוזים שונים של אנדו -β-1,4-xylanase ב 100 מ"מ חיץ נתרן אצטט, pH 4.5 למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר;. E) כימות של תוצרי התגובה מ D באמצעות spectrophotometry אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. ישנן אפשרויות שונות לשימוש assay זה הקרנת אנזים. אפשרות אחת היא להשתמש בצלחת 96-היטב המכילה סוכרים שונים להקרנה, למשל, מספר קטן של (מטוהרים) אנדו -enzymes עם פעילות לא ידועה. במקרה זה התוצאה יראה אשר סוכרים הם degradמסוגלים ידי אנזים היעד. כדי להציג עיקרון זה, -cellulase אנדו נבדק נגד מצעים CPH שונים של 25 מעלות צלזיוס. שלושה ריכוזי אנזים שונים (0.5 U / ml, 1.0 U / ml ו -5 U / ml) הודגרו במשך 30 דקות. התוצאה היא נראית בבירור את צלחת המוצר (איור 2 א). גיליון מוצר אנדו זה -cellulase שמספק לו ההספק מציין פעילות צדדית עבור xyloglucan (תמרהינדי), β-גלוקן שעורה, Glucomannan, xylan Birchwood וצד-פעילות נמוכה עבור galactomannan. בקנה אחד עם זו, פעילות נוספת כדי cellulase נמצאה נגד CPH-β-גלוקן (שעורה), CPH-xyloglucan (תמרהינדי), CPH-xylan (אשור) ופעילות נמוכה נגד-galactomannan CPH (איור 2 ב). Glucomannan לא נבדק. אותו מצעי CPH היו מתעכלים עם אנזימים מסחריים זמינים (בשלושה ריכוזי אנזים שונים: 0.1 U / ml, 0.5 U / ml 1.0 U / ml) לשמש שולטים חיובי באותם תנאים מאשר הקודםלְנַסוֹת. כל המצעים היו מפורקים על ידי אנזים בקרה החיובי ואת עוצמת האות גדלה מתאימה ריכוז אנזים גבוה (איור 2 ג). איור 2. שמונה מצעים CPH שונים הודגרו תחת תסיסה של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. א) צלחת תוצר של מצעים CPH שונים מתעכל עם אנדו -cellulase, בריכוזים שונים. ב) כימות של פעילות ופעילות לוואי שונות של אנדו -cellulase. הברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של ממוצע של שלושה העתקים C) פעילות של אנזימים מסחריים שונים למצע CPH המתאים (אנדו-cellulase ו -2-HE-תאית;. E-LAMSE ו CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-גלוקן (שעורה); E-XYAN4 ו CPH-xylan, E-XEGP ו CPH-xyloglucan, E-BLAAM ו CPH-amylose, E-BMACJ ו CPH-galactomannan; כל האנזימים מן Megazyme). הברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע של שני העתקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. ביומסה chromogenic המסיס (ICB) מצעים הם תוספת שימושית לרפרטואר מצע chromogenic כי הם שומרים חלקית ההסדר הטבעי של סוכרים בקירות תא צמח אשר הם המרכיבים העיקריים של ביומסה. מצעים CPH ו ICB משמשים בדוגמה שלנו לנתח את האנזימים המופרשים של chrysosporium Phanerochaete שכאשר מטפחים במדיום נוזלי. התקנת צלחת צלחת ערכת assay מוצגת באיור 3 א, עם 19 CPH מצעים ו -5 מצעי ICB (4 בארות לכל מצע, האיור 3B). פ chrysosporium היה cultivatאד במשך שלושה ימים ולאחר מכן את supernatant נתח התרבות. לכן, 125 μl 200 מ"מ חיץ הועבר כל supernatant תרבות היטב 25 μl הוסיף. שלושה תנאים pH שונים נבדקו באמצעות חיץ נתרן אצטט pH 4.0, חיץ פוספט נתרן pH 6.0 או pH 8.0 (איור 3 ג). צלחת הודגר רועד (150 סל"ד) בשעה 25 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. מוצרי התגובה הועברו צלחת המוצר (האיור 3D) ונותחו. פ chrysosporium מיוצר אנזימים עבור השפלת גלוקנים שונים, עמילן xylans (איור 3E). אותות התחתון ניתן היה לזהות את arabinan hemicelluloses (סלק סוכר) galactan pectic וכן עבור RGI (סויה). האנזימים המיוצרים היו פעילים יותר בתנאים חומציים (pH 4.0) מאשר ניטראליים או תנאים בסיסיים מעט (pH 8.0). תחתון פעילות לקראת מצעי ICB (איור 3F)מוכיח כי כאשר סוכרים הם בהקשר הטבעי יותר, את היעילות של האנזים הוא לא אותו דבר כמו עם פוליסכריד טהור וזו הסיבה מצעים ICB להפגין תצוגה מציאותית יותר על יעילות האנזים, אם יושם כדי גלם או טרום חומר צמחי מטופלים. הקרנת איור 3. של supernatant התרבות מתרבה נוזלי בן 3 ימים של chrysosporium Phanerochaete באמצעות צלחת מצע רבה המכילה 19 CPH ו -5 מצעי ICB. א) תכנית של התקנת הצלחת עם 4 בארות לכל מצע פרט (רקע אפור = מצעי CPH, רקע כתום = מצעי ICB). ב) תמונה של צלחת assay המכילה את המצע. C) תכנית המציגות את תנאי החיץ השתמשו בניסוי זה (200 מ"מ pH יצטט נתרן 4.0, pH פוספט נתרן 6.0 ונתרן פוספט pH 8.0). ד) תמונה של צלחת המוצר לאחר שעה 2 ב 25 מעלות צלזיוס. E) Absorbances אותר ב 517 ננומטר ו זמם עבור כל מצע פרט CPH ו- F תוצאות מצע ICB) עבור האנזימים בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. מצעי chromogenic יכולים לשמש גם כדי ללמוד תופעות סינרגיסטי באמצעות תערובת של מצעי CPH בצבעים שונים היטב אחד וניתוח supernatant התגובה לאחר טיפול באמצעות אנזימים יחידים או אנזים קוקטיילים. בדוגמה הבאה שמוצג באיור 4, תאית CPH אדום מצעים CPH-xylan צהוב עורבבו יחד לעבר כ סוסיםאל יחס בבארות צלחת מסנן 96-היטב. איור 4 א מציג את תוצרי תגובה בצבע אחרי 1 טיפול שעות בטמפרטורת חדר ללא אנזים (שליטה), cel התאית (2 U / ml), xyl xylanase (1 U / ml) ו תערובת של שניהם אנזימים (3 משכפל עבור כל גישה) במאגר אצטט נתרן 100 מ"מ pH 4.5. לניתוח, המוצר התגובה היה לכמת spectrophotometrically ידי סריקת הספקטרום ספיגת מ 350 ננומטר עד 700 ננומטר (איור 4B). לעתים קרובות בדיקה ויזואלית לבדו יכולה לתת אינדיקציה אם האנזים פועל על מצעים אחת או יותר, אולם רשמה ספקטרום ספיג הנובע צבעים שונים גם יכול להיפתר באמצעות רגרסיה ליניארית פשוטה 8 לתת אינדיקציה מדויקת יותר של ההיקף השפל של כל מצע מהתערובת. באמצעות מצעים CPH כתערובת מוסיף באופן משמעותי את התפוקה של assay, מה שמאפשר SCReening נגד עד 4 מצעים שונים בניסוי אחד (טוב אחד). בדוגמה המוצגת ארבעה מצעים שונים המשמשים: כחול CPH-β-גלוקן (שעורה), צהוב CPH-xylan (אשור), ירוק CPH-amylose ואדום CPH-pectic galactan (תורמוס). הפריסה של צלחת המצע מוצגת באיור 4C ותמונה של צלחת assay באיור 4D. התגובה בוצעה pH חיץ נתרן אצטט 100 מ"מ 4.5 למשך 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס, 150 סל"ד. אנזימי סינגל ראשון עם ריכוז אנזים הגדלה נבדקו עם מצע CPH המתאים (4E איור) ואת supernatant בצבע התקבל כצפוי בצלחת המוצר (איור 4F, בשורה 1A – 12D). שורת E הכילה את CPH-xylan וכחול CPH-β-גלוקן צהוב שני מצעי CPH שונים, אשר היו מפורקים עם יחסים שונים של אנזימים המתאימים אנדו -xylanase ואת אנדו -glucanase. לאחר התגובה, התוצאה היא visible בצלחת המוצר: הצבע של מוצר התגובה הייתה כהה ירוק-כחול, כאשר יותר -glucanase אנדו נכח (איור 4F, 4E-6E) והפך מצית צהוב-ירוק, כאשר ריכוז אנדו -xylanase מוגבר ( איור 4F, 10-12E). אותו בא לידי ביטוי בשורה F, שבו שני מצעים אדומים galactan CPH-pectic וצהוב CPH-xylan היו מפורקים עם אנדו -galactanase ואת אנדו -xylanase. כל ארבעה מצע CPH בצבעים השונה נכח (האיור 4F, 1G-12F) ואנזימים יחידים מושפל מצע CPH המתאים ועל-ידי הוספת נוספי אנזימי שילוב של תוצרי תגובה בצבע התקבל. איור 4. שילוב של שני מצעי CPH שונים, תאי-CPH אדום CPH-xylan הצהוב, שטופל אנזימים שונים. אSupernatants Reaction) לאחר טיפול של שני מצעים עם -cellulase אנדו (CEL) או אנדו -xylanase (xyl) או שניהם אנזימים. B) ספקטרום ספיגת של supernatants התגובה. שילוב של ארבעה מצעים CPH שונים שטופלו אנזימים שונים C) תוכנית של הצלחת המצע המכיל מצעים CPH:. כחול CPH-β-גלוקן (שעורה), צהוב CPH-xylan (אשור), CPH-amylose ירוק CPH- אדום galactan pectic (תורמוס) D) תמונה של צלחת assay המכילה מצעי CPH השונים E) תכנית של צלחת המוצר מראה את היחס בין האנזימים הוסיפו (ריכוזים נומינליים (NC):.. Glu = 1 U / ml אנדו -glucanase, xyl = 1 U / ml אנדו -xylanase, איימי = 5 U / ml אנדו -amylase וגל = 0,5 U / ml אנדו -galactanase). F) תמונה של צלחת המוצר לאחר דגירה 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. מצע מָקוֹר CPH-2-hydroxyethylcellulose N / A (CPH-2-HE-תאי) CPH-amylopectin תפוח אדמה CPH-amylose תפוח אדמה CPH-arabinan סלק סוכר CPH-arabinoxylan חיטה CPH-קזאין חלב שור CPH-chitosan החי CPH-curdlan Alcaligenes faecalis CPH-dextran Spp Leuconostoc. </em> CPH-galactomannan חָרוּב CPH-laminarin Laminaria digitata CPH-lichenan אזוב איסלנדי CPH-methylcellulose N / A CPH-pachyman פוריה קוקוס galactan CPH-pectic תפוח אדמה CPH-pullulan Aureobasidium pullulans CPH-rhamnogalacturonan לי (אני RG) תפוח אדמה CPH-rhamnogalacturonan אני (-Gal) * תפוח אדמה CPH-rhamnogalacturonan שעועית סויה CPH-xylan אשור CPH-xyloglucan תָמָר הוֹדִי CPH-β-גלוקן שעורים שְׂעוֹרָה CPH-β-גלוקן מ שיבולת שועל שיבולת שועל </td> CPH-β-גלוקן משמרים שְׁמָרִים ICB-ארבידופסיס רוזט עלים מ ארבידופסיס thaliana Col-0 (צמח מבוגר) זרעי ICB-ארבידופסיס thaliana ארבידופסיס ICB-ופסולת Officinarum קנה סוכר (צמח מבוגר יבש, גבעול ועלים) ICB-גבישי תאית (נייר סינון) נייר Whatman 3mm Chr כרומטוגרפיה מסחרי זרעי ICB-חלבה Spp גרגרנית. זרעים ICB קנבוס קנאביס spp. (צמח מבוגר יבש, גבעול ועלים) זרעי ICB-תורמוס תורמוס צר עלים זרעים ICB-אבקה פ pratense איטן אבקת pratense ICB-אשוח Spp Picea. (מיילעץ גזע מלא) ICB-טבק משאיר מ ניקוטיאנה benthamiana (צמח צעיר) קש ICB-חיטה Spp Triticum. (צמח מבוגר יבש, גבעול ועלים) ICB-ערבה Salix spp. (צמח מבוגר יבש, עץ מחורץ מטען) ICB-דורה Spp דורה. (משאיר מצמח מבוגרים) * (β-1,4-D-galactan רשתות בצד סיר עם אנדו -β-1,4-D-galactanase) טבלה 1. רשימת זמין chromogenic פולימר הידרוג'ל (CPH) ובחלקם לא מסיסים chromogenic ביומסה (ICB) מצעים.

Discussion

אנחנו משתמשים דור חדש של מצעי CPH ו ICB צבעוניות המבוססים על צבעי chlorotriazine (רשימה מלאה של מצעים בטבלה 1) מסודר ערכת assay מסחרית אישי מעוצב. עיכול אנזימים של מצעי מניב קטנים, מסיסים, מוצרי צבוע אשר ניתן לזיהוי בפתרון assay וניתן לכמת באמצעות צלחת קורא ^9. Assay זה נועד לצורך ההערכה של אנזימי -acting אנדו ואת הרגישות של assay דומה לזו באמצעות azurine הצולב (AZCL) מצעים ^10, בעוד שיטות אחרות זמינות עבור אנזימי -acting exo ^11,12. המגבלה של ערכת assay זה טמון זיהוי של פעילות אנדו -enzyme, כמו CPH כמו גם מצעים ICB אינם מתכלה ידי exo -enzymes ככל הנראה בשל הפרעה סטרית הנובעים מולקולות צבע ו crosslinker ^8.

Assay הוא ביצע ב 96-welפורמט l ותגובות פרט להתקיים הבארות. התגובה צריכה להיות מעורבת הצליח לקבל נתונים לשחזור. את supernatants וכתוצאה יסונן צלחת מוצר שבו הספיג של כל טוב ניתן לכמת באמצעות ספקטרומטריית ספיגה. העקרונות הבסיסיים ואת הפריסה של assay מוצגים באיור 1. את assay מורכב צלחת assay (צלחת מסנן 96-היטב) עם מצעים, ואחרי הדגירה עם אנזימים, supernatant מסוננת דרך לתוך צלחת גם ברור ואת absorbances נקרא מתן מדידה וכמותיות ספציפי ואת פעילות אנזים. הוכח, כי assay הקרנה זו באמצעות מצעי CPH ניתן גם להשתמש בתבנית צלחת אגרה, שבו תוצרי התגובה המסיסים ליצור הילה בצבע לאחר דגירת הלילה. ⁸

ערכות assay יכול לשמש מסך אנזימים מטוהרים-פעילויות הלוואי האפשריות שלהם כפי שמודגםאיור 2. Side-פעילויות יכולות לנבוע אנזים יחיד וספציפי המופקר שלה אלא גם מן העובדה כי המדגם נתח הוא תערובת של אנזימים שונים ותוצאת סינרגטית שלהם צריכה להיחקר. בנוסף, כפי שכבר הוכח במחקרים קודמים, קוקטיילי אנזים הזה, ¹³ חיידקים במעיים והתרבות broths מן הפטריות ⁸ וכן אנזים צמח אנדוגני וחיידקים (נתונים שלא פורסמו) יכול לשמש כמקור אנזים.

מצעי ICB לטפל תערובות מורכבות של רכיבי דופן התא נתקלו לעתים קרובות בתהליכים תעשייתיים של התמוטטות ביומסה. מצעים אלה נועדו להעריך זמינים פוליסכריד ולספק מידע על איך לייעל קוקטיילים שפלים ביעילות לפלט שפלה יעילה יותר. כמו באיור 3 מצעים CPH ו ICB ניתן להשתמש בצד הקרנת אנזים זה לצד זה – חושף שפע של מידע על סגוליות אנזיםפעילות ד הוא בהקשר של המצע המועדף (CPH) וכן קומפלקס טבעי יותר המכיל רכיבים אחרים בנוסף המצע המועדף יותר מקרוב מחק אסיפת macromolecular המצויים בטבע (ICB). השימוש בצבעים מרובים מאפשר זיהוי סימולטני של פעילות אנזים שונה נגד מצעים כמה דבר אשר מגביר את התפוקה הגבוהה multiplexity של assay. ניתן לפתור ספקטרה של צבעים שונים על ידי רגרסיה ליניארית פשוטה, וברוב המקרים פעילות רב מצע יכול להיות שנצפו על ידי בדיקה ויזואלית בלבד. דוגמא מדומה של ניסוי כזה ותוצאותיו מתוארות באיור 4.

ארגז כלי assay זה ואת צדדיות של היישום שלה מתאימים היטב להקרנה הראשונה ברמה של אנזימים סמיכים וצח תרבות עם פעילויות ידועות. ההיבטים החשובים ביותר של assay זה הם טבע תפוקה גבוהה, התאמה אישית, קל שימוש וגמישות. עם זה בחשבון, wדואר מאמין כי מערכת חדשנית זו של כלים תשפר מאוד ולהאיץ תהליכי מיון אנזים תעשייתי כמו גם יישומים אקדמיים.

Materials

assay kit plates	Glycospot		customized assay kit plates
activation solution	Glycospot		for activating CPH substrates
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold	Pall Corporation	5015	spacer block
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile	Millipore	MSHVN4510	assay plate
96-Well Microplates, Polypropylene	Greiner Bio-One	651201	collection plate after washing the substrates
Nunc™ MicroWell™ 96-Well Microplates	Thermo Scientific	269620	product plate
Diaphragm pump MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	vacuum pump used with the vacuum manifold
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (Buch & Holm)	horizontal shaker
SpectraMax M5	Molecular Devices	10067-750 (VWR)	96-well plate absorbance reader
Vacuum manifold	Pall Corporation	5017	vacuum manifold
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)	Megazyme	E-CELTR	cellulase [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus)	Megazyme	E-BMACJ	mannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.)	Megazyme	E-LAMSE	β-glucanase [glu]
endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger)	Megazyme	E-EGALN	galactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger)	Megazyme	E-XYAN4	xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)	Megazyme	E-XEGP	xyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis)	Megazyme	E-BLAAM	amylase [amy]