Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.
In het laatste decennium is er een opleving in het gebruik van plantaardige protoplasten die variëren van model soort tot soort gewas, voor de analyse van signaaloverdracht, transcriptionele regulatorische netwerken, genexpressie, genoom-editing, en gen-silencing is geweest. Bovendien is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de regeneratie van planten uit protoplasten, die nog meer belangstelling voor het gebruik van deze systemen voor plantengenomics heeft gegenereerd. In dit werk is een protocol ontwikkeld voor de automatisering van protoplastisolatie en transformatie van een 'Bright Yellow' 2 (BY-2) tabak schorsing cultuur met behulp van een robot platform. De transformatie procedures zijn gevalideerd met een oranje fluorescerend eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) onder controle van de bloemkoolmozaïekvirus 35S-promoter (35S). OFP expressie in protoplasten werd bevestigd door epifluorescentie microscopie. Analyses omvatte ook protoplast efficiëntie van de productie methoden waarbij propidium jodide. Tenslotte werden goedkope food-grade enzymen die voor de protoplast isolatiewerkwijze, omzeilen de noodzaak van lab-klasse enzymen die kosten prohibitief in high-throughput geautomatiseerde protoplastisolatie en analyse. Op basis van het protocol ontwikkeld in dit werk, kan de volledige procedure van protoplastisolatie transformatie worden uitgevoerd in minder dan 4 uur, zonder enige inbreng van de operator. Terwijl de ontwikkelde in dit werk protocol werd gevalideerd met de BY-2 celkweek, moeten de procedures en methodes vertaalbaar naar alle planten schorsing cultuur / protoplast-systeem, dat de versnelling van het gewas genomics onderzoek moet mogelijk te maken.
In de afgelopen jaren is er een belangrijke impuls gelegd aan het ontwerp van transgene gewassen voor verschillende ziekten 1 te overwinnen, schenken herbicide weerstand 2, overleggen droogte 3,4 en zouttolerantie 5 geweest, herbivorie 6 te voorkomen, te verhogen biomassaopbrengst 7 en celwand weerspannigheid verlagen 8. Deze trend is geholpen door de ontwikkeling van nieuwe moleculaire technieken voor het genereren van transgene planten, waaronder genoom-bewerk, CRISPR Talens en 9, en silencing tot dsRNA 10, 11 miRNA en siRNA 12. Hoewel deze technologieën het genereren van transgene planten hebben vereenvoudigd, hebben ze ook een bottleneck, waarbij het grote aantal transgene planten gegenereerd kunnen niet worden gescreend met behulp van traditionele systemen die afhankelijk zijn van planten regeneratie. Voor dit knelpunt, terwijl zwijgen en genoom-editing constructen kunnen snel in planten worden ingebracht, velegerichte eigenschappen niet het gewenste effect, die vaak niet ontdekt tot planten worden geanalyseerd in de kas te produceren. In dit werk hebben we een werkwijze voor snelle, geautomatiseerde high-throughput screening van plantenprotoplasten ontwikkeld, specifiek de huidige bottleneck begin screening van grote aantallen genoom-editing en silencing streefwaarden.
Het gebruik van protoplasten, in tegenstelling tot intacte plantencellen, heeft een aantal voordelen voor de ontwikkeling van een geautomatiseerd platform. Eerst worden protoplasten geïsoleerd na digestie van de plantencelwand, en deze barrière niet meer aanwezig, wordt transformatie-efficiëntie verhoogd 13. In intacte plantencellen zijn er slechts twee gevestigde methoden voor transformatie, biolistica 14 pt Agrobacterium-gemedieerde transformatie 15. Geen van deze methoden kan gemakkelijk worden vertaald naar liquid handling platforms, zoals biolistica vereist gespecialiseerde apparatuur voor transformatie, terwijl Agrobacterium-gemedieerde transformatie vereist co-cultuur en de daarop volgende verwijdering van de bacteriën. Niet vatbaar voor high throughput methode. Bij protoplasten, transformatie wordt routinematig uitgevoerd met polyethyleenglycol (PEG) bemiddelde transfectie 16, die op verschillende oplossing vereist uitwisseling, en is ideaal voor vloeistofverwerking platforms. Anderzijds protoplasten per definitie zijn eencellige kweken, en dus de problemen van klontering en ketenvorming in plantencelkweken, worden niet waargenomen in protoplasten. In termen van een snelle screening met behulp van een plaat gebaseerde spectrofotometer, samenklontering van cellen, of cellen in meerdere vlakken zal leiden tot moeilijkheden bij het verkrijgen van consistente metingen. Aangezien protoplasten ook dichter dan de kweekmedia ze bezinken op de bodem van putjes, waarbij een monolaag, die bevorderlijk is voor platen gebaseerde spectrofotometrie. Tot slot, terwijl de fabriek celsuspensieculturen zijn primarily afgeleid van callus 17, kunnen protoplasten worden verzameld van verschillende plantenweefsels, waardoor de mogelijkheid om weefselspecifieke expressie te identificeren. Bijvoorbeeld, het vermogen om wortel- of blad-specifieke expressie van een gen te analyseren kan zeer belangrijk fenotype te voorspellen. Daarom werden de die in dit werk protocollen gevalideerd middels protoplasten geïsoleerd uit de veel gebruikte tabak (Nicotiana tabacum L.) Bright Yellow '2 (BY-2) suspensiekweek.
Het BY-2 suspensiekweek is beschreven als het "HeLa" cel van hogere planten door zijn alomtegenwoordige gebruik in moleculaire analyse van 18 plantencellen. Onlangs BY-2 cellen werden gebruikt om de effecten te bestuderen van plantaardige stressoren 19-22, intracellulair eiwit lokalisatie 23,24 en fundamentele celbiologie 25-27 tonen de brede bruikbaarheid van deze culturen in plantenbiologie. Een bijkomend voordeel van BY-2 culturen demogelijkheid om de kweken te synchroniseren met aphidicoline, wat kan leiden tot verbeterde reproduceerbaarheid genexpressiestudies 28. Bovendien zijn werkwijzen ontwikkeld voor de extractie van BY-2 protoplasten met behulp van goedkope enzymen 29,30, enzymen traditioneel gebruikt voor het genereren van protoplasten onbetaalbaar voor high-throughput systemen. Als zodanig heeft de hieronder beschreven protocol gevalideerd met de door-2 suspensiekweek, maar het moet geamendeerd om alle planten celsuspensie cultuur. Proof-of-concept experimenten uitgevoerd met een fluorescentie eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) vanaf het harde koraal Porites Porites 31 onder de controle van de CaMV35S-promoter.
De hierboven beschreven protocol is met succes gevalideerd voor protoplastisolatie, telling, en transformatie met behulp van de door-2 tabak schorsing celkweek; echter, kon het protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar alle planten schorsing cultuur. Op dit moment heeft protoplastisolatie en transformatie gerealiseerd in tal van planten, met inbegrip van maïs (Zea mays) 10, wortel (wilde peen) 32, populier (Populus euphratica) 33, druif (Vitis vinifera)<…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.
Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
Teleshake | Inheco | 3800048 | |
CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
2,4 dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
Poly (ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |