En høy gjennomstrømming, automatisert, tobakk protoplast produksjon og transformasjon metodikk er beskrevet. Den robotsystem gjør massivt parallell genekspresjon og funn i modellen BY-2 system som skal være oversettes til ikke-modellen avlinger.
I løpet av det siste tiåret har det vært en oppblomstring i bruk av planteprotoplaster som spenner fra modellarter for å beskjære arter, for analyse av signaloverføringsveier, transkripsjonsregulerende nettverk, genekspresjon, genom-redigering, og gene-demping. Videre har betydelige fremskritt er gjort i regenerering av planter fra protoplaster, som har generert enda mer interesse i bruken av disse systemene for plantegenomforskning. I dette arbeidet har en protokoll utviklet for automatisering av protoplast isolasjon og transformasjon fra en "Bright Yellow '2 (BY-2) tobakk suspensjonskultur ved hjelp av en robot plattform. De transformasjonsprosedyrer ble validert ved bruk av et oransje fluorescerende protein (OFP) reporter-gen (pporRFP) under kontroll av blomkål mosaikkvirus 35S-promotoren (35S). OFP uttrykk i protoplaster ble bekreftet av epifluorescence mikroskopi. Analyser også inkludert protoplast produksjon effektivitet metoder ved hjelp propidium jod. Til slutt ble lavkost mat-grade enzymer brukes til protoplasten isoleringsprosedyren, omgå behovet for laboratorie vurder enzymer som er kostnads uoverkommelige i high-throughput automatisert protoplast isolasjon og analyse. Basert på den protokoll som er utviklet i dette arbeidet, kan hele prosedyren fra protoplast isolasjon til transformasjon utføres i henhold til 4 timer, uten noen inndata fra operatør. Mens protokoll utviklet i dette arbeidet ble validert med BY-2 cellekultur, bør de prosedyrer og metoder være settes til alle anlegg suspensjon kultur / protoplast system, som skal gjøre det mulig akselerasjon av avlingsgenomforskning.
I de senere årene har det vært en betydelig drivkraft plassert på utformingen av transgene avlinger til å overvinne ulike sykdommer 1, gi gave til ugressmiddel motstand 2, jf tørke 3,4 og salttoleranse 5, forhindre herbivory 6, øke biomassen utbyttet 7, og redusere celleveggen recalcitrance 8. Denne trenden har blitt hjulpet av utviklingen av nye molekylære verktøy for generering av transgene planter, inkludert genom-redigering med CRISPR og Talens 9, og genet stanse gjennom dsRNA 10, miRNA 11, og siRNA 12. Selv om disse teknologiene har forenklet generering av transgene planter, har de også opprettet en flaskehals, der det store antallet av transgene planter som genereres kan ikke bli vist ved hjelp av tradisjonelle systemer som er avhengige av plante regenerering. Relatert til dette flaskehalsen, mens tie og genom-redigering konstruksjoner kan raskt settes inn planter, mange avmålrettede egenskaper mislykkes i å gi den ønskede effekten, som ofte ikke oppdages før plantene er analysert i drivhuset. I dette arbeidet har vi utviklet en metode for rask, automatisert, high-throughput screening av planteprotoplaster, spesielt for å møte den nåværende flaskehals tidlig screening av et stort antall genom-redigering og genet Slå mål.
Bruken av protoplaster, i motsetning til intakte planteceller, har flere fordeler for utvikling av en automatisert plattform. Først blir protoplaster isoleres etter oppslutning av plantecelleveggen, og med denne barrieren ikke lenger er til stede, er transformasjonseffektiviteten økes 13. I intakte planteceller er det bare to godt etablerte metoder for transformasjon, biolistics 14 og Agrobacterium-formidlet transformasjon 15. Ingen av disse metodene kan lett oversettes til væskehåndtering plattformer, som biolistics krever spesialisert utstyr for transformation, mens Agrobacterium-formidlet transformasjon krever ko-kultur og etterfølgende fjerning av bakteriene. Verken er mottagelig for høy gjennomstrømning metoder. I tilfelle av protoplaster, blir transformasjonen rutinemessig utført ved bruk av polyetylenglykol (PEG) -mediert transfeksjon 16, som bare krever flere løsnings utveksling, og er ideelt egnet for væskehåndtering plattformer. For det andre protoplaster, ved definisjon, er enkelt-cellekulturer, og dermed de problemer som er forbundet med klumpdannelse og kjededannelse i plantecellekulturer, ikke blir observert i protoplaster. I form av rask screening ved hjelp av en plate-baserte spektrofotometer, klumper av celler eller celler i flere plan vil føre til vanskeligheter med å skaffe konsistente målinger. Siden protoplaster er også tettere enn deres kulturmedia, de sedimentere til bunnen av brønner, å danne et monolag, som er rette for platebasert spektrofotometri. Til slutt, mens plantecellesuspensjonskulturer er Primarily avledet fra callus 17, kan protoplaster høstes fra en rekke plantemateriale, som fører til evnen til å identifisere vev-spesifikk ekspresjon. For eksempel, evnen til å analysere rot-eller blad-spesifikk ekspresjon av et gen som kan være svært viktig for fenotype forutsigelse. Av disse grunner ble protokollene utviklet i dette arbeidet validert ved bruk av protoplaster isolert fra den mye brukte tobakk (Nicotiana tabacum L.) «Bright Yellow '2 (PR-2) suspensjonskultur.
Den BY-2 suspensjonskultur er blitt beskrevet som "HeLa" celle fra høyere planter, på grunn av dens utbredte anvendelse ved molekylær analyse av planteceller 18. Nylig, AV-2 celler har blitt brukt til å studere effekter av stressfaktorer 19-22, intracellulær protein lokalisering 23,24, og grunnleggende cellebiologi 25-27 demonstrere bred nytten av disse kulturene i plantebiologi. En ekstra fordel av PR-2 kulturer erevne til å synkronisere kulturene med aphidicholin, noe som kan føre til forbedret reproduserbarhet for genuttrykkstudier 28. Videre fremgangsmåter er blitt utviklet for utvinning av PR-2-protoplaster ved hjelp av rimelige enzymer 29,30, som enzymer som tradisjonelt brukes for generering av protoplaster er kostnads prohibitive for high-throughput-systemer. Som sådan har den protokoll som er beskrevet nedenfor blitt validert ved hjelp av PR-2 suspensjonskultur, men det bør være amendable til en hvilken som helst plante cellesuspensjonskultur. Proof-of-concept eksperimenter er utført ved hjelp av et oransje fluorescens protein (OFP) reporter-gen (pporRFP) fra den harde koraller Porites porites 31 under kontroll av CaMV 35S-promotoren.
Protokollen er beskrevet ovenfor har blitt validert for protoplasten isolasjon, telling, og transformasjon ved hjelp av PR-2 tobakksuspensjonscellekultur; imidlertid protokollen kan lett utvides til en hvilken som helst plante suspensjonskultur. I dag har protoplast isolasjon og transformasjon er oppnådd i mange planter, inkludert mais (Zea mays) 10, gulrot (Daucus carota) 32, poppel (Populus Euphratica) 33, drue (Vitis vinifera) 34, oljepa…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.
Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
Teleshake | Inheco | 3800048 | |
CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
2,4 dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
Poly (ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |