En hög genomströmning, automatiserad produktion och omvandling tobaksprotoplast metod beskrivs. Robotsystemet möjliggör massivt parallell genuttryck och upptäckter i modellen BY-2-systemet som ska kunna översättas till icke-modellgrödor.
Under det senaste årtiondet har det skett ett uppsving i användningen av växtprotoplaster som sträcker sig från modellarter att beskära arter, för analys av signaltransduktionsvägar, transkriptionella regulatoriska nätverk, genuttryck, genomet redigering och gen-tyst. Dessutom har betydande framsteg gjorts när det gäller förnyelse av växter från protoplaster, som har genererat ännu mer intresse för användningen av dessa system för växtgenomik. I detta arbete har ett protokoll utvecklats för automatisering av protoplastisolering och omvandling från en "Bright Yellow '2 (BY-2) tobakssuspensionskultur med hjälp av en robot plattform. De transformationsförfaranden validerades med en orange fluorescerande protein (OFP) reportergen (pporRFP) under kontroll av blomkålsmosaikvirus 35S-promotor (35S). OFP uttryck i protoplaster bekräftades av epifluorescensmikroskopi. Analyser ingår också protoplastproduktionseffektivitet metoder med användning propidium jodid. Slutligen var låga livsmedelskvalitet enzymer som används för protoplastisoleringsproceduren, kringgår behovet av labbkvalitet enzymer som är för dyra i hög genomströmning automatiserad protoplastisolering och analys. Baserat på protokoll som utvecklats i detta arbete, kan hela förfarandet från protoplastisolering transformation utföras i enlighet med 4 timmar, utan någon input från operatören. Medan protokoll som utvecklats i detta arbete har validerats med BY-2 cellkultur, bör de förfaranden och metoder kunna översättas till alla växter suspensionskultur / protoplastsystem, som skulle göra det möjligt acceleration av skörde genforskningen.
Under de senaste åren har det skett en betydande drivkraft placeras på utformningen av genmodifierade grödor för att övervinna olika sjukdomar 1, förse herbicidresistens 2, ger torka 3,4 och salttolerans 5, förhindra herbivori 6, öka biomassa avkastning 7, och minska cellväggen motspänstighet 8. Denna trend har med hjälp av utveckling av nya molekylära verktyg för att generera transgena växter, inklusive genomet redigering med hjälp av crispr och Talens 9, och genen tysta genom dsRNA 10, miRNA 11, och siRNA 12. Medan dessa tekniker har förenklat generering av transgena växter, har de också skapat en flaskhals, där det stora antalet transgena växter som genereras inte kan screenas med användning av traditionella system som är beroende av växtregenerering. Relaterat till denna flaskhals, medan tysta och genomet-redigerings konstruktioner kan snabbt införas i växter, många av deriktade drag inte ger önskad effekt, som ofta inte upptäcks förrän växter analyseras i växthuset. I detta arbete har vi utvecklat en metod för snabb, automatiserad, high-throughput screening av växtprotoplaster, särskilt för att ta itu med den nuvarande flaskhalsen i början av screening av ett stort antal genomet redigering och geners uttryck mål.
Användning av protoplaster, i motsats till intakta växtceller, har flera fördelar för utveckling av en automatiserad plattform. Först är protoplaster isolerades efter digerering av växtcellväggen, och med denna barriär inte längre är närvarande, är transformationseffektiviteten ökas 13. I intakta växtceller finns det bara två väl etablerade metoder för transformation, biolistik 14 och Agrobacterium-medierad transformation 15. Ingen av dessa metoder kan lätt översättas till flytande plattformar hantering, som biolistik kräver specialutrustning för Transformation, medan Agrobacterium-medierad transformation kräver co-kultur och efterföljande avlägsnande av bakterierna. Varken är mottagliga för hög genomströmning metoder. I fallet med protoplaster, är transformation rutinmässigt användning av polyetylenglykol (PEG) -medierad transfektion 16, som endast kräver flera lösning utbyte, och är idealisk för flytande plattformar hantering. För det andra, protoplaster, per definition, är encelliga kulturer, och därmed de problem som är förknippade med klumpar och kedja bildning i växtcellodlingar, inte observeras i protoplaster. I termer av snabb screening med användning av en plattbaserad spektrofotometer, hopklumpning av celler, eller celler i flera plan kommer att leda till svårigheter i att förvärva konsekventa mätningar. Eftersom protoplaster är också tätare än deras odlingsmedier, de sedimenterar till botten av brunnar, som bildar ett monoskikt, vilket är gynnsamt för plattbaserad spektrofotometri. Slutligen medan växtcellsuspensionsodlingar är Primarily härrör från callus 17, kan protoplaster skördas från ett antal växtvävnader, vilket leder till förmågan att identifiera vävnadsspecifika uttryck. Till exempel, förmågan att analysera rot- eller bladspecifik expression av en gen kan vara mycket viktigt att fenotyp förutsägelse. Av dessa skäl har de protokoll som utvecklats i detta arbete valideras med hjälp av protoplaster isolerade från utbredda tobak (Nicotiana tabacum L.) Bright Yellow "2 (BY-2) suspensionskultur.
BY-2 suspensionskultur har beskrivits som den "HeLa" cell av högre växter, på grund av dess allmänt utbredda användning i molekylär analys av växtceller 18. Nyligen BY-2-celler har använts för att studera effekterna av växtstress 19-22, intracellulär proteinlokalisering 23,24, och grundläggande cellbiologi 25-27 visar den breda användbarheten av dessa kulturer i växtbiologi. En ytterligare fördel med med-2-odlingar är denmöjligheten att synkronisera kulturerna med afidikolin, vilket kan leda till ökad reproducerbarhet för genuttryck studerar 28. Vidare har metoder utvecklats för utvinning av BY-2 protoplasts använder låga enzymer 29,30, som enzymer som traditionellt används för att generera protoplaster är kostnadseffektiva oöverkomliga för hög genomströmning system. Som sådan har det protokoll som beskrivs nedan validerats med användning av BY-2 suspensionskultur, men det bör vara möjligt att ändra till någon växtcellsuspensionskultur. Proof-of-concept experiment utförs med en orange fluorescerande protein (OFP) reportergen (pporRFP) från de hårda korall porites porites 31 under kontroll av CaMV 35S-promotorn.
Protokollet som beskrivs ovan har framgångsrikt validerats för protoplastisolering, uppräkning, och transformation med hjälp av BY-2 tobakssuspensionscellkultur; kunde dock protokollet lätt utökas till alla växter suspensionskultur. För närvarande har protoplastisolering och omvandling uppnåtts i många växter, inklusive majs (Zea mays) 10, morot (Daucus carota) 32, poppel (Populus euphratica) 33, druva (Vitis vinifera) 34, oljepa…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.
Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
Teleshake | Inheco | 3800048 | |
CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
2,4 dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
Poly (ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |