En Robotic plattform för hög kapacitet Protoplast Isolering och Transformation

Summary

En hög genomströmning, automatiserad produktion och omvandling tobaksprotoplast metod beskrivs. Robotsystemet möjliggör massivt parallell genuttryck och upptäckter i modellen BY-2-systemet som ska kunna översättas till icke-modellgrödor.

Abstract

Under det senaste årtiondet har det skett ett uppsving i användningen av växtprotoplaster som sträcker sig från modellarter att beskära arter, för analys av signaltransduktionsvägar, transkriptionella regulatoriska nätverk, genuttryck, genomet redigering och gen-tyst. Dessutom har betydande framsteg gjorts när det gäller förnyelse av växter från protoplaster, som har genererat ännu mer intresse för användningen av dessa system för växtgenomik. I detta arbete har ett protokoll utvecklats för automatisering av protoplastisolering och omvandling från en "Bright Yellow '2 (BY-2) tobakssuspensionskultur med hjälp av en robot plattform. De transformationsförfaranden validerades med en orange fluorescerande protein (OFP) reportergen (pporRFP) under kontroll av blomkålsmosaikvirus 35S-promotor (35S). OFP uttryck i protoplaster bekräftades av epifluorescensmikroskopi. Analyser ingår också protoplastproduktionseffektivitet metoder med användning propidium jodid. Slutligen var låga livsmedelskvalitet enzymer som används för protoplastisoleringsproceduren, kringgår behovet av labbkvalitet enzymer som är för dyra i hög genomströmning automatiserad protoplastisolering och analys. Baserat på protokoll som utvecklats i detta arbete, kan hela förfarandet från protoplastisolering transformation utföras i enlighet med 4 timmar, utan någon input från operatören. Medan protokoll som utvecklats i detta arbete har validerats med BY-2 cellkultur, bör de förfaranden och metoder kunna översättas till alla växter suspensionskultur / protoplastsystem, som skulle göra det möjligt acceleration av skörde genforskningen.

Introduction

Under de senaste åren har det skett en betydande drivkraft placeras på utformningen av genmodifierade grödor för att övervinna olika sjukdomar ^1, förse herbicidresistens ^2, ger torka ^3,4 och salttolerans ^5, förhindra herbivori ^6, öka biomassa avkastning ^7, och minska cellväggen motspänstighet ^8. Denna trend har med hjälp av utveckling av nya molekylära verktyg för att generera transgena växter, inklusive genomet redigering med hjälp av crispr och Talens ^9, och genen tysta genom dsRNA ^10, miRNA ^11, och siRNA ^12. Medan dessa tekniker har förenklat generering av transgena växter, har de också skapat en flaskhals, där det stora antalet transgena växter som genereras inte kan screenas med användning av traditionella system som är beroende av växtregenerering. Relaterat till denna flaskhals, medan tysta och genomet-redigerings konstruktioner kan snabbt införas i växter, många av deriktade drag inte ger önskad effekt, som ofta inte upptäcks förrän växter analyseras i växthuset. I detta arbete har vi utvecklat en metod för snabb, automatiserad, high-throughput screening av växtprotoplaster, särskilt för att ta itu med den nuvarande flaskhalsen i början av screening av ett stort antal genomet redigering och geners uttryck mål.

Användning av protoplaster, i motsats till intakta växtceller, har flera fördelar för utveckling av en automatiserad plattform. Först är protoplaster isolerades efter digerering av växtcellväggen, och med denna barriär inte längre är närvarande, är transformationseffektiviteten ökas ^13. I intakta växtceller finns det bara två väl etablerade metoder för transformation, biolistik ¹⁴ och Agrobacterium-medierad transformation ^15. Ingen av dessa metoder kan lätt översättas till flytande plattformar hantering, som biolistik kräver specialutrustning för Transformation, medan Agrobacterium-medierad transformation kräver co-kultur och efterföljande avlägsnande av bakterierna. Varken är mottagliga för hög genomströmning metoder. I fallet med protoplaster, är transformation rutinmässigt användning av polyetylenglykol (PEG) -medierad transfektion ^16, som endast kräver flera lösning utbyte, och är idealisk för flytande plattformar hantering. För det andra, protoplaster, per definition, är encelliga kulturer, och därmed de problem som är förknippade med klumpar och kedja bildning i växtcellodlingar, inte observeras i protoplaster. I termer av snabb screening med användning av en plattbaserad spektrofotometer, hopklumpning av celler, eller celler i flera plan kommer att leda till svårigheter i att förvärva konsekventa mätningar. Eftersom protoplaster är också tätare än deras odlingsmedier, de sedimenterar till botten av brunnar, som bildar ett monoskikt, vilket är gynnsamt för plattbaserad spektrofotometri. Slutligen medan växtcellsuspensionsodlingar är Primarily härrör från callus ^17, kan protoplaster skördas från ett antal växtvävnader, vilket leder till förmågan att identifiera vävnadsspecifika uttryck. Till exempel, förmågan att analysera rot- eller bladspecifik expression av en gen kan vara mycket viktigt att fenotyp förutsägelse. Av dessa skäl har de protokoll som utvecklats i detta arbete valideras med hjälp av protoplaster isolerade från utbredda tobak (Nicotiana tabacum L.) Bright Yellow "2 (BY-2) suspensionskultur.

BY-2 suspensionskultur har beskrivits som den "HeLa" cell av högre växter, på grund av dess allmänt utbredda användning i molekylär analys av växtceller ^18. Nyligen BY-2-celler har använts för att studera effekterna av växtstress ^19-22, intracellulär proteinlokalisering ^23,24, och grundläggande cellbiologi ^25-27 visar den breda användbarheten av dessa kulturer i växtbiologi. En ytterligare fördel med med-2-odlingar är denmöjligheten att synkronisera kulturerna med afidikolin, vilket kan leda till ökad reproducerbarhet för genuttryck studerar ^28. Vidare har metoder utvecklats för utvinning av BY-2 protoplasts använder låga enzymer ^29,30, som enzymer som traditionellt används för att generera protoplaster är kostnadseffektiva oöverkomliga för hög genomströmning system. Som sådan har det protokoll som beskrivs nedan validerats med användning av BY-2 suspensionskultur, men det bör vara möjligt att ändra till någon växtcellsuspensionskultur. Proof-of-concept experiment utförs med en orange fluorescerande protein (OFP) reportergen (pporRFP) från de hårda korall porites porites ³¹ under kontroll av CaMV 35S-promotorn.

Protocol

1. Fastställande av Suspension cellkulturer Förbereda flytande BY-2 media genom att tillsätta 4,43 g Linsmaier & Skoog basala medier, 30 g sackaros, 200 mg KH 2 PO 4, och 200 | j, g av 2,4-diklorfenoxiättiksyra (2,4-D) till 900 ml destillerat vatten och pH-värdet till 5,8 med 0,1 M KOH. Efter justering av pH, justera slutvolymen till 1000 ml med destillerat vatten och autoklav. Media kan lagras upp till 2 veckor vid 4 ° C. Inokulera en 250 ml Erlenmeyer-kolv med 100 m…

Representative Results

I den aktuella studien, dubbleringshastighet av BY-2 varierade från 14 till 18 h beroende av den temperatur vid vilken kulturerna inkuberades, i överensstämmelse med tidigare rapporter om en medelcellcykellängd av 15 h. Med denna fördubbling takt, en 1: var 100 börjar inokulum användes för att initiera kulturer, vilket leder till odlingar med en packad cellvolym (PCV) av 50% i 5-7 dagar. I det nuvarande protokollet, där kulturer odlades i 200 ml av media, var en PCV av 100 ml ge…

Discussion

Protokollet som beskrivs ovan har framgångsrikt validerats för protoplastisolering, uppräkning, och transformation med hjälp av BY-2 tobakssuspensionscellkultur; kunde dock protokollet lätt utökas till alla växter suspensionskultur. För närvarande har protoplastisolering och omvandling uppnåtts i många växter, inklusive majs (Zea mays) ^10, morot (Daucus carota) ^32, poppel (Populus euphratica) ^33, druva (Vitis vinifera) ^34, oljepa…

Materials

Orbitor RS Microplate mover	Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler	Agilent
Synergy H1 Multi-mode Reader	BioTek
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser	BioTek
Teleshake	Inheco	3800048
CPAC Ultraflat Heater/cooler	Inheco	7000190
Vworks Automation Software	Agilent		Software used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum Software	Thermo Scientific		Task scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Software	Biotek		Software used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted Microscope	Olympus
Zyla 3-Tap microscope camera	Andor
ET-CY3/TRITC Filter Set	Chroma Technology Corp	49004
Rohament CL	AB Enzymes	sample bottle	low-cost cellulase
Rohapect UF	AB Enzymes	sample bottle	low-cost pectinase
Rohapect 10L	AB Enzymes	sample bottle	low-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal Medium	Phytotechnology Laboratories	L689
2,4 dichlorophenoxyacetic acid	Phytotechnology Laboratories	D295
propidium iodide	Sigma Aldrich	P4170
Poly (ethylene glycol) 4000	Sigma Aldrich	95904-250G-F	Formerly Fluka PEG
Propidium Iodide	Fisher Scientific	25535-16-4	Acros Organics
CaCl2	Sigma Aldrich	C7902-1KG
Sodium Acetate	Fisher Scientific	BP333-500
Mannitol	Sigma Aldrich	M1902-1KG
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
KH2PO4	Fisher Scientific	AC424205000
KOH	Sigma Aldrich	P1767
Gelzan CM	Sigma Aldrich	G1910-250G
6-well plate	Thermo Scientific	103184
96-well 1.2 ml deep well plate	Thermo Scientific	AB-0564
96 well optical bottom plate	Thermo Scientific	165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips	Thermo Scientific	9405 163
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Sigma Aldrich	P4504-1KG
MES	Fisher Scientific	AC17259-5000
MgCl2	Fisher Scientific	M33-500