Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
Einzel klonalen Verfolgung und Analyse auf Vollherzhöhe kann Herzvorläuferzellverhalten und Differenzierung während der Herzentwicklung, bestimmen und für die Untersuchung der zellulären und molekularen Grundlagen von normalen und abnormalen Herzmorphogenese ermöglichen. Neue aufkommende Technologien der retrospektiven Einzel klonalen Analysen machen die Untersuchung von Herz-Morphogenese auf Einzelzellauflösung möglich. Allerdings Gewebe Opazität und Lichtstreuung des Herzens als Abbildungstiefe von ganzem Herzen Bildgebung auf Einzelzellauflösung hinder erhöht. Um diese Hindernisse zu überwinden, eine ganze Embryo Clearing-System, das das Herz hoch transparent für beide Beleuchtung und Detektion machen können, müssen entwickelt werden. Zum Glück, in den letzten Jahren, viele Methoden für die ganze Organismus Clearingsystemen wie CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, kubisch, DBE, BABB und PACT berichtet. Dieses Labor ist daran interessiert, die zellulären und molekularen Mechanismen der KarteIAC Morphogenese. Vor kurzem haben wir einzelne Zelllinie über die ERT2 ROSA26-Cre Tracing; ROSA26-Confetti System zu dünn Label – Zellen während der Herzentwicklung. Wir passten mehrere ganze Embryo-Clearing – Methoden einschließlich Sca le und CUBIC (klar, ungehinderte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) mit whole mount Färbung Bild einzelne Klone im Inneren des Herzens , den Embryo in Kombination zu löschen. Das Herz wurde erfolgreich auf Einzelzell Auflösung abgebildet. Wir fanden , dass Sca le die embryonale Herz beseitigen können, aber die postnatale Herz nicht effektiv beseitigen können, während CUBIC die postnatale Herz beseitigen können, sondern schädigt die embryonale Herz durch das Gewebe auflöst. Die hier beschriebenen Methoden wird die Untersuchung der Genfunktion in einem einzigen Klon Auflösung während kardialen Morphogenese ermöglichen, was seinerseits die zellulären und molekularen Basis angeborener Herzfehler aufdecken kann.
Introduction
Cardiac Morphogenese ist eine sequenzielle Ereignis, das die räumlich – zeitliche Organisation von vier verschiedenen Arten von Herzvorläuferzellen in verschiedene Sektoren des Herzens erforderlich ist , und erfordert auch mehrere Genregulationsnetzwerken diesen Prozess zu dirigieren die funktionelle Herz 1,2 zu bilden. Cardiac Spezifikation, Differenzierung, Strukturierung und Kammer Reifung werden von kardiogenem Transkriptionsfaktoren 3 geregelt. Genetische Mutation oder posttranskriptionalen Aberration dieser Faktoren in Herzvorläuferzellen in entweder embryonale Letalität oder angeborene Herzfehler (CHD) 4 führen könnte. Die Studie von Herzmorphogenese erfordert ein Verständnis der inhärenten strukturellen Details in drei Dimensionen (3D) und einzelne Linie Herzvorläufer markierte Zelle während der Herzentwicklung verfolgt wird das Verständnis der Herzmorphogenese fördern. Eine Reihe von hochauflösenden Abschnitt basierte Tomographieverfahren wurden in th entwickelte vergangenen Jahrzehnten zu Bild Organstruktur 5,6; Allerdings erfordern diese Verfahren teuer, spezialisierte Instrumente, umfangreiche Arbeit, und es fehlt ihnen detaillierte strukturelle Organisation auf Einzelzellauflösung in das endgültige Volumen rekonstruiert Bild 7,8.
3D volumetrischen Bildgebung auf Einzelzellebene stellt ein Mittel Vorläuferzelldifferenzierung und Zellverhalten in vivo 7 zu untersuchen. Allerdings bleibt Gewebe Lichtstreuung das primäre Hindernis Zellen und Strukturen in 3D tief im Inneren des intakten Herzens Bildgebung. Lipide sind eine Hauptquelle der Lichtstreuung, und die Entfernung von Lipiden und / oder Einstellung des Brechungsindexunterschied zwischen Lipiden und deren Umgebung sind mögliche Ansätze zur Erhöhung der Gewebetransparenz 8. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Gewebeclearingverfahren entwickelt, das Gewebe Opazität und Lichtstreuung zu reduzieren, wie BABB (Benzylalkohol und Benzyl benzoate-Gemisch) und DBE (Tetrahydrofuran und Dibenzylether); aber bei diesen Verfahren, Fluoreszenzlöschung bleibt ein Problem 8-10. Die Lösungsmittelbasis hydrophile Methoden, wie SeeDB (Fructose / Thioglycerin) und 3DISCO (Dichlormethan / Dibenzylether), erhalten Fluoreszenzsignale, aber machen nicht das ganze Organ transparent 7,8,11. Im Vergleich dazu macht die CLARITY Gewebe-Clearing – Verfahren der Organ transparent, aber es erfordert eine spezialisierte Elektrophoreseautomat Lipide zu entfernen 8,12, ebenso wie PACT (passive Klarheit Technik), die auch Hydrogel 7,13 Einbettung erfordert. Detaillierte Informationen zu allen verfügbaren Gewebe-Clearing – Verfahren, siehe Tabelle 1 in Richardson und Lichtman et al. 7.
Im Jahr 2011 Hama et al. Serendipitously eine hydrophile Mischung 'Sca le' (Harnstoff, Glycerin und Triton X-100 – Gemisch) entdeckt , das macht das Gehirn der Maus und Embryo durchsichent während vollständig fluoreszierende Signale von markierten Klone 14 zu erhalten. Dies ermöglicht die Abbildung des intakten Gehirn in einer Tiefe von mehreren Millimetern und großen Rekonstruktion von neuronalen Populationen und Vorsprünge an einer subzellulären Auflösung. Susaki et al. weiter verbessert Sca le von Aminoalkoholen und entwickelte die "CUBIC" ( eine klare, uneingeschränkte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) Gewebe Clearing – Verfahren, das Phospholipid Solubilisierung reduziert Klärzeit erhöht und erlaubt für den Mehrfarbenfluoreszenzabbildung 8 hinzugefügt wird . In der vorliegenden Studie, die Vorteile der le Sca nehmen und CUBIC Gewebe Clearing Techniken und hochauflösende 3D – optischen Schneidens, einzelne Klone innerhalb des Herzens während der Herzentwicklung wurden unter Verwendung von Rosa26Cre ERT2 verfolgt 15, R26R-Confetti 16, & alpha; MHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong> NFATc1-Cre 19 und Rosa26-mTmG (mTmG) 20 Mauslinien. Die Kombination der whole mount – Färbung (WMS) Verfahren weiterhin für die Färbung von anderen Proteinen in markierten Klone und für die Untersuchung ihres Verhaltens in einem 3D – Volumen Kontext erlaubt zuvor 21,22 mit Gewebe Verrechnungsverfahren entwickelt. Die Kombination von Gewebe Clearing- und WMS ermöglicht ein besseres Verständnis der Rolle der verschiedenen Gene und Proteine während der Herzentwicklung und der Ätiologie von angeborenen Herzfehlern. Dieses Protokoll kann angewandt werden, um andere Vorläuferzelldifferenzierung, Zellverhalten zu untersuchen und organ Morphogenese Ereignisse während der Entwicklung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Embryo Isolation ist ein sehr wichtiger Schritt. E9.5 Embryonen sind sehr zerbrechlich und klein, so besonders darauf geachtet werden, sollten nicht die Embryo / Herzstrukturen während der Isolierung nicht zu beschädigen. Die nicht-embryonale zusätzliche Schichten des Embryos / Herz umhüllt sollte sorgfältig besonders entfernt werden, wenn die gesamte Embryo-Bildgebung. Auf diese Weise können Antikörper und Clearing-Mischung Eindringen tief in den embryonalen Geweben und hilft auch das Hintergrundsignal bei d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
Referências
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