Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
Singolo tracing clonale e analisi a livello intero cuore può determinare il comportamento delle cellule progenitrici cardiache e differenziazione durante lo sviluppo cardiaco, e consentire lo studio delle basi cellulari e molecolari della morfogenesi cardiaca normale e anormale. Recenti tecnologie emergenti di retrospettive singole analisi clonali rendono lo studio della morfogenesi cardiaca a risoluzione singola cella fattibile. Tuttavia, l'opacità dei tessuti e la dispersione della luce del cuore come la profondità delle immagini è aumentata Hinder di imaging intero-cuore con una risoluzione di singola cellula. Per superare questi ostacoli, un sistema di compensazione intero embrione che può rendere il cuore altamente trasparente sia per l'illuminazione e la rilevazione devono essere sviluppati. Fortunatamente, negli ultimi anni, sono stati segnalati molti metodologie per sistemi di compensazione intero organismo, come la chiarezza, la Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cubi, DBE, BABB e PACT. Questo laboratorio è interessato ai meccanismi cellulari e molecolari della cartaIAC morfogenesi. Recentemente, abbiamo stabilito singola linea cellulare tracciare tramite il ROSA26-Cre ERT2; sistema ROSA26-Confetti alle cellule di etichette scarsamente durante lo sviluppo cardiaco. Abbiamo adattato diverse metodologie embrio-clearing interi compresi Sca le e cubi (chiare, senza ostacoli cocktail di imaging cerebrale e analisi computazionale) per cancellare l'embrione in combinazione con tutto il monte colorazione di immagine singoli cloni all'interno del cuore. Il cuore è stato ripreso con successo ad una risoluzione di singola cellula. Abbiamo trovato che le Sca può cancellare il cuore embrionale, ma non può efficacemente eliminare cuore postnatale, mentre CUBIC può cancellare cuore postnatale, ma danneggia il cuore embrionale sciogliendo il tessuto. I metodi qui descritti permetteranno lo studio della funzione genica in una sola risoluzione clone durante morfogenesi cardiaca, che, a sua volta, può rivelare basi cellulari e molecolari dei difetti cardiaci congeniti.
Introduction
Morfogenesi cardiaca è un evento sequenziale che richiede l'organizzazione spaziotemporale di quattro diversi tipi di cellule progenitrici cardiache in settori distinti del cuore, e richiede anche più reti di regolazione genetica di orchestrare questo processo per formare il 1,2 cardiaca funzionale. Cardiac specificazione, differenziazione, patterning, e la maturazione della camera sono regolati da fattori di trascrizione cardiogeno 3. Mutazione genetica o aberrazione posttranscriptional di questi fattori nelle cellule progenitrici cardiache possono provocare sia letalità embrionale o difetti cardiaci congeniti (CHD) 4. Lo studio della morfogenesi cardiaca richiede una comprensione dei dettagli inerenti strutturali in tre dimensioni (3D) e singola etichetta lignaggio cellule progenitrici cardiache tracciamento durante lo sviluppo cardiaco promuoverà la comprensione della morfogenesi cardiaca. Un certo numero di sezione metodi basati tomografia ad alta risoluzione sono stati sviluppati in the negli ultimi decenni a immagine Struttura organo 5,6; tuttavia, questi metodi richiedono costosi, strumenti specializzati, il lavoro esteso, e la mancanza di organizzazione strutturale dettagliata alla risoluzione di singola cellula nel volumetrico finale ricostruita immagine 7,8.
L'imaging volumetrico 3D a livello di singola cellula fornisce un mezzo per studiare la differenziazione delle cellule progenitrici e comportamento cellulare in vivo 7. Tuttavia, la luce tessuto dispersione rimane l'ostacolo principale per l'imaging cellule e strutture in 3D in profondità all'interno del cuore intatto. I lipidi sono una fonte importante di diffusione della luce, e la rimozione dei lipidi e / o regolazione della differenza di indice di rifrazione tra i lipidi e le aree circostanti sono potenziali approcci per aumentare la trasparenza del tessuto 8. Negli ultimi anni, un certo numero di metodi di compensazione del tessuto sono stati sviluppati, che riducono l'opacità dei tessuti e diffusione della luce, come BABB (alcool benzilico e benzile benzoate miscela) e DBE (tetraidrofurano e dibenzylether); ma in questi metodi, fluorescenza quenching rimane un problema 8-10. Il solvente basa metodi idrofili, come SeeDB (fruttosio / thioglycerol) e 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), conserva segnali fluorescenti, ma non rende l'intero organo trasparente 7,8,11. In confronto, il metodo tessuto-clearing CLARITY rende l'organo trasparente, ma richiede un dispositivo per elettroforesi specializzata per rimuovere i lipidi 8,12, come fa PACT (tecnica passiva chiarezza), che richiede anche idrogel incorporamento 7,13. Per informazioni dettagliate su tutti i metodi di tessuto-compensazione disponibili, fare riferimento alla Tabella 1 a Richardson e Lichtman, et al. 7.
Nel 2011, Hama et al. Casualmente scoperto una miscela idrofila 'Sca Le' (urea, glicerolo e Triton X-100 miscela) che rende il cervello di topo ed embrione traspaent mentre completamente preservando segnali fluorescenti da cloni etichettati 14. Questo permette l'imaging del cervello intatto ad una profondità di diversi millimetri e ricostruzione su larga scala di popolazioni neuronali e proiezioni a una risoluzione subcellulare. Susaki et al. ulteriormente migliorata Sca Le aggiungendo amminoalcoli e sviluppato il 'cubica (chiare, senza ostacoli cocktail di brain imaging e analisi computazionale) Metodo tessuto compensazione, che ha aumentato la solubilizzazione fosfolipide, riduzione dei tempi di compensazione, e ha permesso per l'imaging a fluorescenza multicolore 8. Nel presente studio, approfittando della Sca Le e Cubic tecniche del tessuto di compensazione e alta risoluzione sezionamento ottico 3D, i singoli cloni all'interno del cuore durante cardiogenesis sono stati rintracciati utilizzando Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong> NFATc1-Cre 19, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linee di mouse. La combinazione del metodo tutto il monte colorazione (WMS) sviluppato in precedenza 21,22 con metodi di compensazione tessuto ulteriormente consentiti per la colorazione di altre proteine in cloni etichettati e per lo studio del loro comportamento in un contesto volumetrica 3D. La combinazione di compensazione tessuti e WMS permette una migliore comprensione dei ruoli dei diversi geni e proteine durante lo sviluppo cardiaco, e l'eziologia di difetti cardiaci congeniti. Questo protocollo può essere applicato per studiare altre differenziazione di cellule progenitrici, comportamento cellulare, ed eventi morfogenesi organo durante lo sviluppo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'isolamento embrione è un passo molto importante. embrioni E9.5 sono molto fragili e di piccole dimensioni, in modo da la cura dovrebbe essere presa per non danneggiare le strutture dell'embrione / cardiaci durante l'isolamento. Gli strati aggiuntivi non embrionali che avvolgono l'embrione / cuore devono essere rimossi con attenzione soprattutto quando l'imaging tutta dell'embrione. Questo permette la penetrazione di anticorpi e di compensazione miscela in profondità all'interno dei tessut…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
Referências
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. . The atlas of mouse development. , (1992).
- Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Developement. 127, 1607-1616 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
