Abstract
שיטה מתוארת לפיה נקודה קוונטית (QD) חלקיקים יכולים לשמש ללימודי immunocytochemical גומלים של רקמות הפתולוגיה אנושיות באמצעות מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי widefield במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM). כדי להדגים את הפרוטוקול לנו immunolabeled סעיפי אפוקסי ultrathin של גידול somatostatinoma האנושי באמצעות נוגדן ראשוני סומטוסטטין, ואחריו נוגדנים משני biotinylated ויזואליזציה עם מצומדות streptavidin 585 ננומטר קדמיום-סלניום (CdSe) נקודות קוונטיות (QDs). הסעיפים הם רכובים על רשת הדגימה TEM ממוקם אז בשקופית זכוכית להסתכלות על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי widefield. במיקרוסקופ אור מגלה תיוג QD 585 ננומטר כמו קרינה כתומה בהירה ויוצרת דפוס נקודתית בתוך הציטופלסמה התאים הסרטניים. בשעה נמוכה הגדלה אמצע טווח על ידי מיקרוסקופ אור דפוס התיוג ניתן להכיר בקלות את רמת התיוג שאינו ספציפי או רקע העריכה. זהו קריטיצעד לפרשנות הבאה של דפוס immunolabeling ידי TEM וערכה של ההקשר מורפולוגיים. הסעיף אותו דבר ואז מחק יבש שנצפה על ידי TEM. בדיקות QD נראות תצורפנה חומר אמורפי כלול גרגרי פרשת פרט. תמונות נרכשות מאותו האזור של (ROI) העניין לראות על ידי מיקרוסקופ אור לניתוח גומל. מקביל תמונות מודליות כל יכול אז להיות מעורבב כדי כיסוי נתוני קרינה על ultrastructure TEM של האזור המתאים.
Introduction
אור גומל במיקרוסקופ אלקטרונים (קלם) הוא גישה חזקה לניתוח אירועים דינמיים חולפים 1, 2 אירועים נדירים, 3 ומורכב 4 מערכות. יש תמורות רבות טכניות שונות זמינות 5 תלויים השאלה נשאלת אולם דרישה נפוצה היא כי אותו המבנה יחיד מדגם 6 הוא צלם ידי שיטות מיקרוסקופיה מרובות. הגישה שלנו בפרט כדי קלם פותחה לחקר רקמות הפתולוגיה האנושית ארכיוני והמקרה משמש כאן כבר מאופיין היטב שפורסמו בעבר 7. המטרה הייתה קודם כל, על מנת למקסם את הנתונים אנליטיים מ ביופסיה אחת או מדגם כירורגית ושנית, להשתמש במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי כדי לעזור להבהיר את ההקשר של דפוס תיוג immunocytochemical לראות ברמת ultrastructural.
nanocrystals נקודה קוונטית (QDs) מציעה את הפוטנציאל של ABL מערכת סמן אוניוורסלידואר כדי שיוצג על ידי שניהם, מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי במיקרוסקופ האלקטרונים 8, 9, 10. מבנה ליבת הגבישים שלהם מאפשר QDs בגדלים שונים כדי ליצור מגוון רחב של פסגות פליטת קרינה כאשר ירגש על ידי אור באורכי גל רחוק ספקטרום הפליטה שלהם 11. המשקל האטומי שלהם מספיק כדי להניב צפיפות אלקטרונים כי ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים, מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכי סריקה (STEM) או במיקרוסקופ אלקטרוני סורק פליטת שדה. הם מתאימים במיוחד ללימודי immunocytochemical כמו QDs האחת אפילו אפשר לראות מתן רגישות אולטימטיבית של QD אחד לכל מולקולת יעד 12. יתר על כן, תלוי QD בשימוש הם יכולים להחזיק חתימת יסודות פרט מתאימה למיפוי.
דגימות לפתולוגיה אדם להציע יתרונות משמעותיים למחקר ביו translational. דגימות רקמות ביופסיה כירורגית מוגשים באופן שגרתי עבור biobanking ועם appropניתן לגשת אתיקה סיווג riate ללימודי מחקר. רקמה אנושית אין בעיות של שייכות או פרשנות שיכול להתרחש חיים או במודלים חוץ גופית של המחלה. עם זאת, הכנת דגימה של דגימות לפתולוגיה לעתים קרובות אינה אופטימלית. לא יכול להיות עיכוב ברקמה שיוצב מקבע, מקבעים הולם בשימוש כגון פורמלין ולא glutaraldehyde עבור TEM ודגימה הולמת. יש שיטות קלם הפוטנציאל לייעל את מידע אבחון פרוגנוסטיים זמין ממדגם אנושי אחת. עם זאת, כמה גישות מצטרף חדש שפותחו כגון אלה העסקה מחולל חמצן גופייה מיני (miniSOG) אינן זמינות לשימוש פתולוגיה בשל הצורך עבור התג להיות מקודדים גנטיים לתוך תא העניין 13. מסיבה זו אנו בחנו את התועלת של תיוג QD של רקמות TEM מוכנות שגרתי ללימודי immunocytochemical גומלים. QDs להחיל אפוקסי חרוט או חלקים שרף אקרילי מ lightly אלדהיד דגימות ביופסיה ורקמות קבועים להציע את האפשרות לקבל מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי גומל ונתוני TEM ממדגם יחיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמות 1. Dissection ו קיבוע
- Dissection רקמות
- לנתח חתיכות רקמת ביופסית דגימה או רקמת גידול resected בניתוח.
ההערה: הרקמה השתמשה במחקר זה הייתה קבוע שגרתי בפורמלין אבל רקמה טריה היא גם מתאימה. בחרנו שטח אשר ודיווח על ידי פתולוג אנטומיים להכיל גידול somatostatinoma לאחר צביעה היסטולוגית שיגרתית immunostaining אנטי-סומטוסטטין (לא מוצגים). - השתמש פיסות רקמה לא גדולות יותר מ 1.0 מ"מ 3.
- לנתח חתיכות רקמת ביופסית דגימה או רקמת גידול resected בניתוח.
- Cacodylate הצפת הכנה
- הכן פתרון חיץ המניה (1 M) על ידי הוספת 21.4 גרם של cacodylate נתרן (ראה רשימת חומרים) ו -3.0 מ"ל של 1% תמיסה של קלציום כלוריד 90 מ"ל מים מזוקקים ולאחר מכן מילאו הפתרון לנפח סופי של 100 מ"ל. מערבב את הפתרון ולהשאיר אותו לעמוד לילה כך מגיב הגבישים מתמוסס לחלוטין.
- הכנה מקבע ושימוש
- להוסיף אחד 10 מ"ל אמפולה של פתרון glutaraldehyde 50% עד 20 מ"ל של תמיסת נתרן cacodylate המניה (1 M). הוספת הכספים במים מזוקקים 190 מ"ל. בדוק את ה- pH ולהתאים 7.4 על ידי הוספת 1 - 4 טיפות של חומצה הידרוכלורית 3% (HCl) במידת הצורך.
- הוספת הכספים עם מים מזוקקים לעשות נפח סופי של 200 מ"ל.
- לטבול את רקמת מקבע המכיל glutaraldehyde 2.5% ב- pH חיץ cacodylate 0.1 M נתרן 7.4 למשך 24 שעות ב 4 o בתוך שפופרת מדגם זכוכית. בטל מקבע בשימוש לאחר שבוע 1.
עיבוד רקמות 2. והטבעה
- אוסמיום טטרוxide מכתים
- לאחר הקיבוע הושלם, לטבול את רקמת חיץ נתרן cacodylate (0.1 M) למשך 20 דקות ולאחר מכן לחזור עוד 20 דקות.
- כן tetroxide אוסמיום מימית 2% (OSO 4) עובד פתרון על ידי הוספת 8.0 מיליליטר של פתרון 5% OSO 4 מניות 2.0 מיליליטר של תמיסה למלאי נתרן cacodylate (1 M) ו 10.0 מיליליטר של מים מזוקקים לעשות נפח סופי של 20.0 מ"ל.
- הסר את חוצץ ואז לטבול את הרקמה 2% OSO 4 ב- pH 7.4 למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
זהירות! היזהר בעת decanting והכין פתרונות OSO 4, ללבוש ציוד מגן אישי מתאים ולעבוד במנדף בכל העת.
- Uranyl Acetate מכתים
- לאחר רקמות osmication תושלם, להסיר את הפתרון OSO 4 לטבול רקמות נתרן אצטט 2% למשך 10 דקות. הסר נתרן אצטט 2% אז לטבול אצטט uranyl 2% עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- התייבשות
- מייבשי רקמות באמצעות כהלים מדורגים. השתמש 50% אתנול עבור 10 דקות, 70% אתנול למשך 10 דקות, 95% אתנול למשך 10 דקות ושני שינויים של אתנול 100% במשך 20 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
- בצע שני שינויים של אצטון 100% במשך 30 דקות כל אחד.
- שרף הספגה ו אשפרה
- מערבבי שרף אפוקסי צמיגות נמוכה בכוס פוליאתילן חד פעמית. הוסף 10.0 גרם של פחמן דו ויניל ציקלוהקסן (ERL 4221) מונומר אפוקסי, 6 גרם של diglycidyl האתר של גליקול פוליפרופילן (DER 732) ו 26.0 גרם של אנהידריד succinic nonenyl (NSA). מערבבים היטב ביד באמצעות מקלות עץ למשך 2 דקות.
- להוסיף רבע טיפות של 2-dimethylaminoethanol (DMAE) אפוקסי מאיץ ומערבבים שוב למשך 2 דקות. תשמור על עצמך כדי לערבב את ERL מלא, DER ו NSA הרכיבים לפני הוספת מאיץ DMAE.
- התחל הספגה שרף של הרקמה על ידי החלפת אצטון 100% עם 1: 1 שרףאצטון עבור שעה 1, ולאחר מכן להחליף עם 6: 1 שרף אצטון עבור 3 שעות, ולבסוף 100% שרף לילה.
- העברת רקמה לתוך בטרי ב 8 micromoulds מ"מ. קיור לני C 70 o. שרף צריך להיות קשה אך לא שביר לאחר הריפוי.
3. Ultramicrotomy
- סכין, חיתוך פרמטרי עובי סעיף
- מניח סכין יהלום semithin ב ultramicrotome וחותך חלקים מהרקמה בעובי של 500 ננומטר.
- Float סעיפים על אמבט מים מאחורי קצה הסכין. תרים את הסעיפים בשקופית זכוכית ולייבש אותם במשך 10 עד 20 שניות באמצעות פלטה חשמלית ב כ 110 מעלות צלסיוס
- Etch את החלקים עם פתרון ethoxide נתרן במשך 20 שניות ולאחר מכן לשטוף עם 100% אז אתנול במים מזוקקים. כתם עם 2% מתילן כחול בורקס 1% למשך 20 שניות על הפלטה החשמלית, לשטוף עם מים זורמים מברז במשך 5 שניות ויבשות על הפלטה החשמלית במשך 5 שניות. ואז stain עם 1.5% fuchsin בסיסי על הפלטה החשמלית במשך 5 שניות ואז יבשה על הפלטה החמה למשך 20 שניות.
- בדוק על ידי מיקרוסקופ אור בהיר השדה ולאשר כי תאים סרטניים וכן באזור (ROI) ריבית נוכחי הסעיף.
- שנה את סכין יהלום semithin אל סכין יהלום ultrathin ולהגדיר את מהירות זווית וחיתוך סכין הנכונה כפי מומלץ על ידי יצרן הסכין.
- חותכים סעיפים ultrathin ב 90 עובי ננומטר. שים את צבע הזהב של חלקים כאשר צף על המים באמבטיה.
- למתוח ולשטח בסעיפים בהנפת אדי כלורופורם מחתיכת 1 ס"מ 2 של נייר סינון בתוך כמה מילימטרים של סעיפים. יש להיזהר שלא להביא את נייר ספוגה כלורופורם במגע עם פני המים.
- שמת Ultrathin סעיף Grid
- הרם את סעיפי ultrathin ממשטח המים באמצעות רשת TEM ניקל 300-רשת דקה ברה כי נטבל בסעיף adhesivפתרון דואר. אתר את החלקים בצד המשעמם של הרשת. יש רשתות משטח עמום או מאט בצד אחד משטח מלוטש או מבריק בצד השני. שום סרט תמיכה נדרש. הערה: יש צורך להתמודד עם רשתות אלה עם מלקחיים אנטי-מגנטי, כדי למנוע רשתות דבק מלקחיים.
- הכן את דבק בסעיף ידי הצבת 20 ס"מ של נייר דבק ברור בתוך 5 מ"ל בקבוקון עם 2.0 מ"ל של אצטון. שווי ולנער את הבקבוקון, ולתת לעמוד במשך 10 דקות ולאחר מכן להסיר את סרט משאיר הפתרון הדבק.
4. immunolabeling
- חשיפת Antigen
- כן 1 מיליליטר של תמיסת תחריט metaperiodate נתרן רוויה טריה במים מזוקקים ולהשתמש בו מייד. טיפות מקום פתרון התחריט על משטח labfilm נקי.
- מניח רשתות יבשות לחלוטין עם קטעים למטה על טיפות של תמיסת נתרן metaperiodate בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. מעבירים את רשתות כדי dro מים מזוקקיםplets עבור 60 שניות של כביסה.
- דגירת נוגדנים ואת QD Probe תיוג
- בצע את כל incubations וסימון על טיפות של תמיסת מונח על משטח Parafilm נקי.
- מניחים את הרשת על טיפה של 0.05 מ 'גליצין ב PBS במשך 10 דקות כדי לחסום אלדהיד השיורי הסעיף. הסר את הבלוק אלדהיד ידי סופג בקצה בקצרה של הרשת.
- מניחים את הרשת על טיפה של סרום עיזים 1% נורמלי (NGS) ו -1% BSAC (10%) ב PBS במשך 10 דקות. הכן את הפתרון חוסם על ידי הוספת 10 μl של NGS ו 100 μl של BSAC 890 μl של PBS לתת נפח סופי של 1,000 μl.
- להתנות את הסעיפים על ידי הצבת על טיפה של diluent נוגדן עבור 10 דקות.
- בצע את הדגירה immunolabeling באמצעות נוגדן polyclonal אנטי סומטוסטטין מדולל 1:10 עם diluent נוגדן נותן ריכוז של 3.47 g / L. הערה: דגירת נוגדן נעשתה על ידי הצבת רשתות על טיפות עבור שעה 1 ב חדר לטמפרטורותיור בתא לח.
- הסר מגיב נוגדן משלב 4.2.5 באמצעות מחיקת הקצה של הרשת ולאחר מכן לשטוף מדורי diluent עבור 2 x 5 דקות.
- מדגירים את נוגדנים משני (polyclonal נגד ארנב עז biotinylated) מדולל 01:10 עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון נוגדנים משני. לשטוף diluent עבור 2 x 5 דקות.
- מדגירים QDs מצומדות streptavidin (585 ננומטר) מדולל 01:10 עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. מכסים ברדיד אלומיניום כדי להפחית חשיפה לאור במהלך הדגירה.
- לשטוף רשתות במים מזוקקים טריים למשך 2 דקות. למחוק את הקצוות של יבש הרשת.
5. מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי
- קוביות מקור ומסנן אור
- השתמש 365 ננומטר אור דיודה פולטת (LED) תאורה עבור במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי רחב בתחום. הכנס קובייה מסננת עם המאפיינים הבאים: (שמות ז 365 ננומטר, BS FT 395 וא"מ LP 420 ננומטר).
הערה: קובייה מסננת זה wחולה להתיר ספקטרום הפליטה של כל QDs גדל להיות דמיין בו זמנית תחת גל העירור אותו.
- השתמש 365 ננומטר אור דיודה פולטת (LED) תאורה עבור במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי רחב בתחום. הכנס קובייה מסננת עם המאפיינים הבאים: (שמות ז 365 ננומטר, BS FT 395 וא"מ LP 420 ננומטר).
- סעיפים צופים והדמיה
- הצב את הקטע לרשת immunostained למטה בשקופית זכוכית טיפה של מים ומכסה להחליק כיסוי זכוכית (מספר עובי 1.5). השתמש במיקרוסקופ אור להעריך את דפוס תיוג, רמת שום תיוג הלא ספציפית לקבוע כי בקרות שליליות ברורות של תיוג.
- זהה ROI ביחס לברי רשת. רשתות Finder יכולות לעזור לך ליצור קואורדינטות של מבני יעד.
- לרכוש תמונות של תיוג חיובי על סעיף שימוש במצלמה דיגיטלית בצבע מלא עם הגדרת המצלמה "צבע FL אוטומטי" ו "איזון לבן" נקבע על 3,200K. השתמש במצלמה "חשיפה אוטומטית" מצב עם הגדרה "גמא" בין 0.45 ל -1.00 כדי לייעל את המראה של תמונות "רווח אנלוגי" נקבע על 1x.לחץ על סמל המצלמה בממשק הגרפי תוכנת הזן 2 לייט "לחיות", למקד את התמונה ולאחר מכן לחץ על "צמד" כדי ללכוד את התמונה אל Framestore.
- שמור תמונות כמו .tif קבצים להימנע דחיסה pixelation מתחוור לי יותר ויותר.
- כן הדפסה המראה את המיקום של ROI ביחס סורגי הרשת או נקודות ציון רקמות משמעותיות אחרות. דפסים אלו יהיו שימושיים עבור הניווט הבא של הסעיף מחדש מציאת ROIs ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים (TEM).
- הסר את הרשת משקופית, לשטוף במים מזוקקים בעדינות למחוק את הקצוות יבשים.
הערה: אל תשתמש תאורה חזקה מדי כדי לרכוש תמונות קרינה. Photostability של QDs מאפשר פעמי הדמיה של עד מספר שניות אך היזהר שלא להאריך חשיפה כמו מרווה של אות QD יכולה להתרחש לאחר כ 1 דקות במים. photostability מורחבת או קבועה מתקבלת רק כאשר QD שכותרתו חלקים מיובשים עם טולואןמוטבע תחת coverslips בהתאם למפרטי היצרן. עם זאת, תהליך זה אז יהיה לשלול את האפשרות של בדיקה גומלת מאותו הקטע על ידי TEM.
6. מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים
- עד וצפייה TEM הגדר
- מעבירים את הרשת אל TEM לבדיקה באמצעות מתח מואץ של 100 קילו וולט. השתמש בהגדלה נמוכה של כ 1,400X כדי לנווט ברחבי הרשת ולמצוא ROIs מתואם עם נוף מיקרוסקופ האור. אשכולות צפה של QDs בהגדלות סביב 50,000X.
- שים QDs פרט בהגדלת 70,000X ומעלה. שים לב QDs כמו מבנים גבישיים סדירים עם צפיפות אלקטרונים מתונה.
- הַדמָיָה
- השתמש במצלמה דיגיטלית הדמיה TEM. חיישן פיקסל מונוכרום 1,392 x 1,040 הוא נאות.
- לרכוש תמונות על ידי לחיצה על סמל "מצלמה" למצב "On" של microscope ממשק גרפי של תוכנת ההדמיה, אז כדי "כבוי" כדי לאחסן את התמונה Framestore. הערה: פעולות אלה תהיינה שונים בהתאם למערכת מיקרוסקופ בשימוש. השתמש במצלמה במצב חשיפה אוטומטית עם הגדרה "גמא" של 1.00.
- שמור תמונות כמו .tif קבצים.
7. הדמיה קלם
- איתור ROI הקרין על ידי TEM
- השתמש הדפסה מהתמונה מיקרוסקופ אור לאתר המתאים ROIs ידי TEM. מאפיינים אדריכליים רקמות כגון כלי דם ומבנים לומינל שימושיים ניווטת סביב הסעיף באמצעות TEM.
- צילום תמונה של ROI המקביל ידי TEM.
- תמונת כיסוי קלם
- ודא שתמונת TEM פונה כראוי עם תמונת מיקרוסקופ אור ולתקן את ההרחבה של כל כך אותו המבנה ניכר בכל מודאליות הוא באותו הגודל.
- מִזְרָחאכל את מיקרוסקופ אור תמונות TEM ולהציג אותם Side-by-side או כשכבות כדי להדגיש את התכונות ultrastructural של ROIs immunolabeled.
- צור תמונת שכבה באמצעות Photoshop CS2. ראשית, להגדיל את התמונה הקרינה לאותו ההגדלה כתמונת TEM צריכת חשמל נמוכה. להתמצא שתי התמונות ולאחר מכן להדביק אותם זה לצד זה על בד אחד.
- לשטח את התמונה.
- צור את שכבת הקרינה מן התמונה מורכבת זו. הקש על "הכלי המלבן האפריון", לבחור את תמונת הקרינה וליצור שכבה כפולה ממנו.
- התאם את "סגנון שכבה / Blending Options" עד 30 - 40% שקיפות.
- הקש על "עבר הכלי" וגרור את שכבת כיסוי קרינה מעל תמונת TEM המקבילה. יישר את התמונות.
- לאחר שהשיג את היישור, "שיטוח" השכבות לייצר את תמונת השכבה הסופית.
- השתמש "כלי מלבני אפריון" כדי לבחור את תמונת שכבת-העל החדשהnd להעתיק אותו בד חדש. שמור את זה בתור קובץ .tiff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדגימה הגידול somatostatinoma נעשה שימוש במחקר זה מורכב תאים סרטניים להרכיב מבנים ductal מעורבב עם רקמת stomal collagenous. על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי, תאים סרטניים בודדים שהכיל גרגרי הפרשה בשפע הראו תיוג חיובי עבור ההורמון סומטוסטטין. גרעינים הופיעו חורים כהים עם תיוג הלא ספציפי מזערי לזיהוי (איור 1). בהגדלות נמוכות, קרינה כתומה עזה פרטני variably נתפסה בציטופלסמה של תאים סרטניים היטב מאופיינים אלה. הצבע הכתום של קרינה נקבע על ידי הגודל של QD בשימוש. במחקר זה השתמשנו 585 QDs ננומטר אשר פולט אות כתומה כאשר נרגש עם 365 אור ננומטר.
ניתוח קלם של אותו התא היה אפשרי (איור 2). שימוש באותה הרשת כפי שנצפה על ידי מיקרוסקופ אור עבור ROIs שניתן לבדוק את TEM שיכיר ו- IMבגילאי בשני אופנים. אותו מבנה הרקמה ביחס לברי רשת כפי שניתן לראות על ידי מיקרוסקופ אור נצפה על ידי TEM והשתמש לניווט. את ההחזר על ההשקעה נמצאה על ידי פנייה תמונת מיקרוסקופ אור 20X, ותוך לקיחה בחשבון תכונות רקמות ביחס לברים הרשת.
TEM הראה הציטופלסמה של התאים החיוביים סומטוסטטין להכיל גרגירים עגולים בשפע של משתנה צפיפות אלקטרונים. גרגרי בקטרים שונים נכחו תאים בודדים QD צפיפות immunolabeling על הגרגרים היה גם משתנה. שכיסה של נתוני קרינה על תמונות TEM הציע תיוג חיובי חזק תואם גרגירים המכילים אלקטרוני חומר צפוף בינוני בתוך קרום הגבלת השלפוחית (איור 3).
בהגדלה גבוהה יותר גרגרי צפוף אלקטרונים בינוני יכול לראות כדי immunolabeled באינטנסיביות עם nanocrystals QD ( 
איור 1:. אור מיקרוסקופי צפו של סעיף אולטרה-דק עם תאי Somatostatinoma תווית עבור הורמון Somatostatin סעיף ultrathin היה רכוב על רשת TEM, immunolabeled, ולאחר מכן הניח בשקופית זכוכית במים תחת coverslip. תאי Somatostatinoma (חיצים) להראות גרעינים עגולים גרגרים חיוביים הורמון סומטוסטטין בשפע בציטופלסמה. הבדלים ניכרים צפיפות תיוג נתפסת אוכלוסיית תא somatostatinoma (200X). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 2: קלם Composite צפה מתוך סעיף Ultrathin באמצעות Somatostatin רקמות OMA המסומנות לשימוש Somatostatin א) בתאי Somatostatinoma ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield (120X);. ב) בתאים אותו סביב לומן (L) נתפס על ידי TEM בהגדלה נמוכה (570X); C) נוף TEM כוח גבוה מראה תא ניאון בהיר מ ( א) עם גרעין (N) (2,000X);. D) פרט גרנולות ציטופלסמית מראה תיוג אינטנסיבי עם QDs על חומר אמורפי הכלול בתוך גרגר (כוכבית) (20,000X) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו . 
איור 3:. תמונת כיסוי קלם דמות שקופה מ מיקרוסקופ פלואורסצנטי מעורבב עם תמונת TEM של האזור המתאים (2,000X)./ftp_upload/54307/54307fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 4: מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים (TEM) צפייה של Somatostatin חיובי גרגרים מן Somatostatinoma Cell הציטופלסמה הורמון Somatostatin גרגר חיובי בציטופלסמה (חיצים) צג לוקליזציה QD על תוכן אמורפי בעיקר בתוך הממברנה המגביל.. מסביב רקע ציטופלסמית נקי עם כמה בדיקות QD מאליו. חלק תיוג הגרעין הלא ספציפי נתפס. קרום השלפוחית סביב הגרגרים (חיצים) עדיין גלוי (50,000X). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה הוכיח את התועלת הפוטנציאלית של QDs כמו בדיקות אוניברסליות ללימודים קלם. חלקיקי QD 585 ננומטר בשימוש הראו קרינה בהירה ויציבה כאשר נצפים על ידי מיקרוסקופ אור widefield ונצפו בקלות על ידי TEM. מחקר קודם על ידי אחד הסופרים הנוכחי הוכיח QDs גם להיות מתאים מיקרוסקופ אור סופר-רזולוציה 7. photostability שלהם היה שימושי במיוחד לתקופות צפייה מורחבות וחשיפות הדמיה ארוכות. QDs יכול לשמש גם עבור אימונוהיסטוכימיה זמנית עם בדיקות בגדלים שונים הפולטים ספקטרום בצבעים שונים בו זמנית תחת אותו גל עירור.
QDs להחזיק משקל אטומי מספיק כדי להיות דמיינו ידי TEM אבל זה נמצא להיות מאתגר תלוי בגודל של ננו-חלקיקים בשימוש. עבור מיקרוסקופ אור, מצאנו כי 525 ננומטר QDs (ירוק) לייצר תיוג רקע פחות בהשוואה ננומטר 585 גדול (כתום) 655 ננומטר (אדום) צורות. עם זאת, בחרנו להשתמש QD 585 ננומטר הגדול במחקר הנוכחי על מנת לאפשר ראיה נוחה יותר של התיוג על ידי TEM. QDs 525 ננומטר הקטן הוא בגודל כ 3 - 5 ננומטר ואילו צורות ננומטר 585 הגדולות כ 6 - ננומטר 8 ואת 655 QDs ננומטר כ 8 - 10 ננומטר. 585 QDs ננומטר ניחן בכושר גבישים סדיר עם צפיפות אלקטרונים מתונה כאשר נצפה על ידי TEM. הם לא היו כמו עגולים או כמו אלקטרונים צפופים כמו חלליות immunocytochemical זהב קולואידים המסורתיות יותר. עם זאת, QDs הוכח להניב עד 10X תיוג יעיל יותר מאשר זהב colloidal 9 ואנחנו אשרנו פה כי צפיפות תיוג גבוהה הייתה ברת השגה בקלות, במיוחד עם מערכת מקשר החללית ביוטין-streptavidin. QDs CdSe גם בעלי חתימה היסודות מאפיין שעשויים לאפשר זיהוי ומיפוי באמצעות ספקטרוסקופיית נפיצה אנרגיה (EDS), ספקטרוסקופיה אובדן האנרגיה אלקטרון (צלופחים) או במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מסוננים אנרגיה (EFTEM) 8. במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכי סריקה (STEM) מערכות יכול להיות מועסקת גם בשל ניצולם של ניגודיות Z או הדמית מספר אטומית אשר היה לשפר ניגוד בין חלקיקי חומר ביולוגי של מספר האטומי נמוך 14. מיפוי והדמיה שטח גדול של מידע הפצה 3D 15 עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה צריך להיות גם אפשרי.
שלב קריטי השיטה שלנו הוא הליך תחריט בסעיף הסרת מסכות או אנטיגן. אנו משתמשים טיפול יחיד עם metaperiodate נתרן במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. זמן רב יותר מאשר זה וצבירה של מבנים או אובדן ההגדרה הממברנה יכול להתרחש. אחרים השתמשו בשיטה דו-צעד המעורב deplasticizing עם נתרן methoxide ואחריו דה-osmication עם periodate נתרן זו עשויה לספק יותר שליטה על התהליך אם 16 הכרחיים.
קלם היה אפשרי באמצעות מיקרוסקופ אור כדי carefully להיכנס התכונות המבניות של ROIs ביחס לברי רשת. אותו לרשת מושמת אז TEM ו חוקית כך סורגים ובציוני הדרך מייצגות תצוגת מיקרוסקופ האור. בהגדלה נמוכה של כ 1,400X הוא המתאים ביותר לכך. מבני רקמות כגון היווצרות ductal ודפוסי הגרעינים הוכיחו להיות שימושי ביותר עבור מחדש מציאת ROIs בתוך הרקמה. עם זאת, מתאם מדויק עם רזולוצית תא אותו יכול להיות מאתגר. טיפול ונלקח עם הכיוון של הרשת על מנת לשקף את אותה נטייה לראות על ידי מיקרוסקופ אור. השגנו קורלציה מרחבית subcellular המדויקת באופן סביר בין אופנים עם תמונות כיסוי הופקו באמצעות פוטושופ. תמונת השכבה-על הקרינה הייתה מעורבבת עם תמונת רקע TEM אולם כמה חוסר תיאום לא הורגש. זה יכול להיות בגלל מערכות ההדמיה השונות הנהוגים בכל אפנות או לניזקי קרינת סעיפי ultrathin הנתמכים שלנו TEM. מערכות אוטומטיות עבור stאורינג הקואורדינטות של ROIs לראות על ידי מיקרוסקופ אור והעברת אלה כדי מיקרוסקופ אלקטרונים עכשיו משווקות לציבור הרחב והיה מאוד לפשט הליך זה.
השירות של גישת קלם שהצגנו ללימודי immunocytochemical הוא בהכרח מוגבל לפי שיטת הכנת דגימה בשימוש, כלומר, מכתים מתכות כבדות והטבעת שרף אפוקסי בהכרח מיסוך אפיטופים זמין. עם זאת, הטכניקה מרשה תועלת הרבה קבלת נתוני קרינה ו TEM ממדגם פתולוגיה. קבלת מידע מבני ותפקודי ממערכות מיקרוסקופיה שונות באמצעות מדגם יחיד היא דבר שלא היה זמין בדרך כלל מחקרים של תאי הפתולוגיה אנושיים ורקמות כי עובדו בעיקר למטרות אבחון.
זה יהיה צפוי כי לוקליזציה immunocytochemical רגיש יותר ניתן היה לקבל גישה קיבעון ההקפאה ולא ב פרוטוקולased על קיבעון כימי. אימוץ עקרונות cryofixation 17 עבור biobanking של רקמה האנושית ואחריו cryoultramicrotomy ו בטמפרטורת חדר מבוסס QD immunolabeling כמו טכניקת Tokuyasu הקלסית 18, 19 יקל מחקרי immunocytochemical גומלים רגישים וספציפיים של בהיווצרות מחלה אנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 - 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up! Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M.
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M.
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T.
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
