तैयारी और Lipophilic डॉक्सोरूबिसिन समर्थक दवा micelles की विशेषता
Summary
तैयारी और lipophilic डॉक्सोरूबिसिन समर्थक दवा के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल लोड 1,2-distearoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine- एन – [अमीनो (पॉलीथीन ग्लाइकोल) -2000] (डीएसपीई-खूंटी) micelles वर्णन किया गया है।
Abstract
Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.
Introduction
रसायन चिकित्सा आमतौर पर कैंसर के विभिन्न रूपों के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है। अधिकांश, नहीं तो सब, रसायन चिकित्सा दवाओं विषाक्त दुष्प्रभाव जो इस तरह के मतली और दस्त के रूप में प्रबंधनीय नाबालिग की स्थिति, से अधिक की धमकी दे जीवन की स्थितियों के लिए भिन्न हो सकते हैं, लोगों की है। क्योंकि अधिकांश विरोधी दवाओं विषाक्त कर रहे हैं, सामान्य ऊतकों को इन दवाओं के गैर चयनात्मक जोखिम अनिवार्य रूप से विषाक्तता का कारण बनता है। इसलिए, वहाँ एक चिकित्सकीय दृष्टिकोण है कि चुनिंदा कैंसर की कोशिकाओं को दवाओं में वितरित कर सकते हैं के लिए एक बड़ी जरूरत है। विरोधी दवाओं के प्रशासन के साथ एक और चुनौती उनके गरीब पानी घुलनशीलता है। आमतौर पर, solubilizing एजेंट इन खराब घुलनशील दवाओं को तैयार करने की जरूरत है। हालांकि, इस तरह डाइमिथाइल sulfoxide के रूप में सबसे solubilizing एजेंटों, (DMSO), Cremophor ईएल, और 80 Polysorbate (बीच 80) इसलिए जिगर और गुर्दे की विषाक्तता, hemolysis, तीव्र अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं और परिधीय न्यूरोपैथीस का कारण बन सकता है। 1, सुरक्षित और biocompatible योगों के लिए आवश्यक हैं गरीबों के नैदानिक इस्तेमालLy घुलनशील विरोधी दवाओं। Nanocarriers ऊपर चुनौतियों को संबोधित करने के लिए दवा वितरण प्रणाली वादा कर रहे हैं। ये nanocarriers liposomes, 2 नैनोकणों, 3 micelles, 4-7 बहुलक दवा conjugates, 8 और अकार्बनिक सामग्री शामिल है। 9 कई nanomedicine उत्पादों (जैसे, Doxil, Abraxane, और Genexol) नियामक एजेंसियों द्वारा अनुमोदित किया गया है कैंसर रोगियों का इलाज करने के लिए। 10
Polymeric micelles नैनो पैमाने पर दवा वितरण वाहक, जो सफलतापूर्वक विरोधी दवाओं के वितरण के लिए इस्तेमाल किया गया वादा कर रहे हैं। 4-7,11,12 ठेठ बहुलक micelles एक आत्म विधानसभा की प्रक्रिया के माध्यम से amphiphilic पॉलिमर से तैयार किया जाता है। कोर-खोल संरचित बहुलक micelles एक हाइड्रोफिलिक खोल और एक हाइड्रोफोबिक कोर में शामिल हैं। हाइड्रोफिलिक खोल sterically micelles को स्थिर है और रक्त प्रवाह में अपने परिचालन को लम्बा खींच कर सकते हैं। हाइड्रोफोबिक कोर प्रभावी ढंग से encapsulate कर सकते हैं हाइड्रोफोबिक घआसनों। micelles (आम तौर पर कम से कम 200 एनएम) और लंबे समय से प्रचलन गुण के छोटे आकार की वजह से, बहुलक micelles ट्यूमर बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (EPR) प्रभाव (निष्क्रिय ट्यूमर को निशाना) के माध्यम से लक्षित कर प्राप्त करने के लिए माना जाता है।
ड्रग लोडिंग स्थिरता ट्यूमर को निशाना micelles की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है। इष्टतम ट्यूमर लक्ष्य-निर्धारण को प्राप्त करने के लिए, micelles ट्यूमर साइट तक पहुँचने से पहले कम से कम दवा रिसाव होना चाहिए, फिर भी जल्दी से कैंसर की कोशिकाओं में प्रवेश करने के बाद दवा जारी। इसके अलावा, निर्माण स्थिरता भी उत्पाद विकास के लिए एक अनिवार्य आवश्यकता है, क्योंकि निर्माण स्थिरता उत्पाद विकास की व्यवहार्यता, साथ ही विकसित उत्पादों की शेल्फ जीवन को निर्धारित करता है। हाल ही में, प्रसव के वाहक में दवाओं की लोडिंग में सुधार के लिए काफी प्रयास किया गया है। Lipophilic समर्थक दवा दृष्टिकोण एक रणनीति है जो लिपिड नैनोकणों और emulsions में दवा लोड हो रहा है सुधार करने के लिए पता लगाया गया है conj है। 13,14दवाओं के साथ लिपिड के ugation काफी उनके lipophilicity में सुधार लाने और nanocarriers की lipophilic घटकों में लोड हो रहा है और प्रतिधारण वृद्धि कर सकते हैं।
यहाँ, हम lipophilic डॉक्सोरूबिसिन समर्थक दवा भरी हुई micelles तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। सबसे पहले, lipophilic समर्थक दवा डॉक्सोरूबिसिन के लिए संश्लेषण प्रक्रिया में वर्णित है। फिर, एक फिल्म के फैलाव विधि के साथ micelles पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश किया है। इस विधि को सफलतापूर्वक हमारे पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है। 5 डीएसपीई खूंटी micelles तैयारी क्योंकि इसे सफलतापूर्वक मिसेल दवा वितरण के लिए इस्तेमाल किया गया है के लिए वाहक सामग्री के रूप में चयनित किया गया था। 15,16 अंत में, हम कई इन विट्रो मिसेल को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया assays का वर्णन योगों और विरोधी गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में, हम micelles की तैयारी के लिए एक सीधी, तेजी से फिल्म फैलाव विधि का वर्णन है। (जैसे, डीएसपीई-खूंटी) एक जलीय वातावरण में कोर-खोल संरचित micelles फार्म के लिए इस पद्धति का एक amphiphilic बहुलक की आत्म विधानसभा गुण …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.
Materials
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| BAKER FLEX TLC PLATES | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
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