إعداد وتوصيف محبة للدهون دوكسوروبيسين المذيلات الموالية للعقار
Summary
بروتوكول لإعداد وتوصيف دوكسوروبيسين محبة للدهون المؤيدة للمخدرات تحميل 1،2-distearoyl- التعطيل -glycero-3-phosphoethanolamine- N – [الأمينية (البولي ايثيلين جلايكول) -2000] يوصف (DSPE-PEG) المذيلات.
Abstract
Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.
Introduction
ويستخدم العلاج الكيميائي عادة لعلاج أشكال مختلفة من أمراض السرطان. معظم، إن لم يكن كلها، أدوية العلاج الكيميائي لها آثار جانبية سامة والتي قد تختلف من الشروط البسيطة يمكن التحكم فيها، مثل الغثيان والإسهال، لظروف تهدد حياة أكثر. لأن معظم الأدوية المضادة للسرطان سامة، والتعرض غير انتقائي من هذه الأدوية إلى الأنسجة الطبيعية يسبب حتما سمية. لذلك، هناك حاجة ماسة لنهج العلاجي الذي يمكن أن يحقق انتقائي المخدرات إلى الخلايا السرطانية. وهناك تحد آخر مع إدارة الأدوية المضادة للسرطان ضعيف الذوبان في الماء الخاصة بهم. عادة، لا بد من وكلاء الانحلال لصياغة هذه الأدوية قليلة الانحلال. ومع ذلك، فإن معظم وكلاء الانحلال، مثل سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس])، Cremophor EL، وبوليسوربات 80 (توين 80) قد يسبب الكبد والتسمم الكلوي، انحلال الدم، تفاعلات فرط الحساسية الحادة واعتلال الأعصاب المحيطية. 1 لذلك، هناك حاجة إلى تركيبات آمنة وحيويا ل استخدام السريري للفقراءالأدوية المضادة للسرطان القابلة للذوبان لاي. Nanocarriers واعدة أنظمة توصيل الدواء للتصدي للتحديات المذكورة أعلاه. وتشمل هذه nanocarriers الجسيمات الشحمية، 2 النانوية، 3 المذيلات، 4-7 تقارن البوليمر المخدرات و 8 و المواد غير العضوية. 9 العديد من المنتجات النانوي (على سبيل المثال، Doxil، Abraxane، وGenexol) وقد تمت الموافقة من قبل الهيئات التنظيمية لعلاج مرضى السرطان. 10
المذيلات البوليمرية واعدة ناقلات تسليم المخدرات مقياس النانو، والتي تم استخدامها بنجاح لإيصال الأدوية المضادة للسرطان. وتعد 4-7،11،12 المذيلات البوليمرية النموذجية من البوليمرات محبة للجهتين من خلال عملية التجميع الذاتي. وتشمل الأساسية قذيفة المذيلات البوليمرية المركبة قذيفة ماء والأساسية مسعور. قذيفة ماء يمكن تحقيق الاستقرار sterically المذيلات وإطالة تداولها في مجرى الدم. جوهر مسعور يمكن أن تلخص على نحو فعال د مسعورالسجاد. ونظرا لصغر حجم المذيلات (عادة ما تكون أقل من 200 نانومتر) وخصائص التداول منذ فترة طويلة، ويعتقد أن المذيلات البوليمرية لتحقيق الورم تستهدف من خلال تعزيز نفاذية والاستبقاء (EPR) آثار (استهداف الورم السلبي).
استقرار تحميل الدواء هو أمر حاسم لورم تستهدف قدرة المذيلات. لتحقيق استهداف الورم الأمثل، يجب أن يكون المذيلات الحد الأدنى من تسرب المخدرات قبل الوصول إلى موقع الورم، ولكن بسرعة الافراج عن المخدرات بعد دخول الخلايا السرطانية. وبالإضافة إلى ذلك، الاستقرار صياغة هو أيضا شرط أساسي لتطوير المنتجات، وذلك لأن الاستقرار صياغة يحدد جدوى تطوير المنتجات، فضلا عن العمر الافتراضي للمنتجات المتقدمة. مؤخرا، تم إحراز الكثير من الجهد لتحسين التحميل من المخدرات داخل أجسام ناقلة التسليم. النهج المؤيدة للمخدرات محبة للدهون هي استراتيجية التي تم استكشافها لتحسين تحميل المخدرات في النانوية الدهون والمستحلبات. 13،14 في حرف عطفugation من الدهون مع العقاقير يمكن أن تحسن إلى حد كبير بالانجذاب وتعزيز التحميل والاحتفاظ في مكونات المحب للدهون nanocarriers.
هنا، نحن تصف بروتوكول لإعداد دوكسوروبيسين محبة للدهون المؤيدة للمخدرات المذيلات تحميل. أولا، يتم وصف الإجراء التوليف لدوكسوروبيسين محبة للدهون المؤيدة للمخدرات. ثم، يتم إدخال بروتوكول لتوليد المذيلات مع طريقة فيلم والتشتت. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح في دراساتنا السابقة. وقد تم اختيار 5 DSPE-PEG كمادة حاملة لإعداد المذيلات لأنه كان قد تم استخدامها بنجاح لتسليم مذيلة المخدرات. 15،16 أخيرا، وصفنا عدة فحوصات في المختبر يستخدم لوصف مذيلة تركيبات ولتقييم النشاط المضادة للسرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل، نحن تصف وسريع طريقة فيلم تشتت غير معقدة لإعداد المذيلات. هذه الطريقة تستخدم خصائص التجميع الذاتي من البوليمر محبة للجهتين (على سبيل المثال، DSPE-PEG) لتشكيل نواة قذيفة المذيلات منظم في بيئة مائية. هذه طريقة إعداد مذيلة ديها العديد من المزايا. 1. كان ينطو…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.
Materials
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| BAKER FLEX TLC PLATES | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
Referências
- Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle?. ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
- Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).
- Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).
- Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd, ., D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).
- Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).
- Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9 (2011).
- Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).
- Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).
- Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).
- Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles – a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).
- Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).
- Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2′-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).
- Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).
- Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).
- Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
- Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
- Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).
- Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).
- Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).
- Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).
- Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).
