競争力の移植は、造血幹細胞のフィットネスを評価します
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
造血が損傷、放射線と細胞死によって失われた血液細胞の補充を確実に再生プロセスです。この処理は、主に成人の骨髄に存在する造血幹細胞（HSC）によって保証されます。また、造血幹細胞は、自己免疫疾患、血液悪性腫瘍および免疫不全1で治療目的のために使用することができます。よりよいそれらの増殖拡大と到達し、移植後のレシピエントの骨髄を生着する能力を含む、HSC機能を制御する機構を理解する必要性が存在します。最近の研究は、将来に向かって約50％の純度2-4に大人のHSCおよび胎児HSCを豊かにするSLAMファミリーメンバーCD150及びCD48を含むいくつかの細胞表面マーカーを、報告しているが、機能的な造血幹細胞のためのゴールドスタンダード尺度はへのin vivo再増殖アッセイのまま血液cを再確立する能力を決定します照射されたホスト5のエル生産。
in vivoでのクローン再増殖アッセイは、最初にティルとマカロック6が開発し、以来、洗練され、拡張されました。もともと定義されているように、HSCは自己複製と分化を通じて生涯の血液細胞の生産を確保します。異なる血液細胞系統（Tリンパ球、Bリンパ球、顆粒球、単球）、および連続移植を介して、自己再生能力の分析を介して分化する能力を：照射レシピエントへのHSCの転送は、このように我々が評価することを可能にします。アッセイは、通常、機能性および/ またはHSCの2つの集団の量の比較を伴うだろう、 例えば 、細胞が造血幹細胞の維持や拡大に影響を与える可能性が別の因子で処理または未処理された異なる遺伝子型または細胞の2匹のマウスから来ます文化インチドナーキメラ、または転送されたドナーのHSCトンの貢献O血液細胞産生は、受信者、またはホストからのドナー細胞を区別する細胞表面マーカーまたは他の方法を用いて、末梢血および骨髄にフローサイトメトリー解析によって決定することができます。最も広く使用されているマーカーは確かに私たちは下記の実施例のために選択した遺伝子PtprcまたはCD45白血球抗原7のための2つの対立遺伝子です。
クローン再増殖アッセイは、競合的または非競合的のいずれかであることができます。非競合的設定では、対照および試験HSCは別個のレシピエントマウスに移し、各細胞型のための結果は、他の独立したであろう。競争力のある設定では、試験および対照両方HSCの機能は、競合他社HSCの集団に対して測定されます。ここで説明するプロトコルは、競争力のある設定を使用しても、非競合的状況に適合させることができます。どちらのアプローチは、その利点と限界を持っている、と私たちは中に詳細にそれらを比較します討論。我々はまた、移植されたHSCの数の株式を確保するための様々なアプローチを説明し、希釈アッセイ（LDA）を制限することにより、HSCの定量化のためのアッセイを適合させ、結果の解釈のための成功と失敗の移植の両方の例を提供する方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、既知の競合他社のHSCに対するドナー（テスト）HSCの相対的な適合性を評価するために設計されています。競争の状況は（幹細胞のフィットネスの緩やかな減少を検出する可能性が高い）アッセイの相対感度を向上させ、照射し、注射の有効性のための内部の技術的な制御を提供します。しかし、それはHSCのフィットネスの絶対的な尺度として使用されるべきで?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、手続きのフィギュアデザインとデモの支援のためにRoxannエテュ-アーバーに感謝しています。ラボでの研究が発見はありません付与、コール財団からの移行賞によってサポートされていました。自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）とイノベーションのためのカナダ基金（CFIリーダーファンドはありません。31377を付与）419226から2012。サンテ（FRQS） – KMHは、フォンデRECHERCHEケベックためChercheur-Boursierジュニアです。
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
Referências
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