השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
Hematopoiesis הוא תהליך התחדשות המבטיח את replenishing של תאי דם אבדו בגלל פציעה, קרינת מוות של תאים. תהליך זה מובטח על ידי תאי גזע hematopoietic (HSC) השוכנים בעיקר במח העצם הבוגר. בנוסף, תאי גזע hematopoietic יכול לשמש למטרות טיפוליות במחלות אוטואימוניות, מחלות ממאירות המטולוגית ו חסרים חיסוניים 1. יש אפוא צורך להבין טוב יותר את המנגנונים המווסתים פונקציה HSC, ובכלל זה, הרחבת שגשוג שלהם ואת יכולתם להגיע נקלטים במח העצם הנמען לאחר ההשתלה. למרות מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו מספר סמנים פני התא, כולל בני משפחה SLAM CD150 ו CD48, להעשיר HSCs מבוגר פרוספקטיבית HSCs העובר בכ -50% טוהר 2-4, המדד תקן הזהב עבור HSCs פונקציונלי נשאר in vivo repopulating assay כדי לקבוע את יכולתם להקים מחדש ג דםייצור ell ב מארח מוקרן 5.
את assay repopulating in vivo המשובטים בתחילה פותח על ידי טיל מקול'ץ 6 ומאז שוכלל והורחב. כהגדרתם במקור, HSCs להבטיח ייצור תאי דם חיים, דרך התחדשות עצמית והבחנה. העברת HSCs לתוך נמען מוקרן ובכך מאפשרת לנו להעריך: יכולתי להבחין באמצעות הניתוח של שושלות תאי דם השונות (לימפוציטים מסוג T, לימפוציטים מסוג B, גרנולוציטים, מונוציטים) ויכולים עבור התחדשות עצמית באמצעות השתלת סדרתי. את assay בדרך כלל יהיה כרוך ההשוואה של פונקציונליות ו / או כמות של שתי אוכלוסיות של HSCs, למשל, תאים המגיעים שני עכברים של גנוטיפים או תאים שונים אשר טופלו או מטופלים עם גורמים שונים שיכולים להשפיע על תחזוקה או הרחבה של HSCs בתרבות. chimerism התורם, או התרומה של התורם מועבר HSCs tייצור תאי דם o אז יכול להיקבע על ידי ניתוח תזרים cytometry בדם ההיקפי ומח עצם באמצעות סמנים פני תא או שיטות אחרות אשר להבחין בין תאי תורם מן הנמען, או מארח. הסמנים הנפוצים ביותר הם ללא ספק שני אללים של הגן Ptprc או לויקוציטים CD45 אנטיגן 7 שבחרנו עבור הדוגמות להלן.
את assay והאכלוס המשובט יכול להיות תחרותי או לא תחרותי. באווירה הלא תחרותית, HSCs מלא הבדיקה מועבר לעכברי נמען נפרדים ואת התוצאה עבור כל סוג תא תהיה עצמאית של אחרים. על רקע תחרותי, הפונקציה של שני HSCs הבדיקה והבקרה נמדדה כנגד אוכלוסייה של המתחרה HSCs. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בהגדרה התחרותית אבל יכול גם להיות מותאם למצבים שאינם תחרותיים. יש שני גישות היתרונות והמגבלות שלהם, ואנו להשוות אותם בפירוטדִיוּן. כמו כן, אנו מתארים גישות שונות על מנת להבטיח הון במספר HSCs המושתל, להסביר כיצד להתאים את assay עבור כימות של HSCs על ידי הגבלת assay דילול (LDA), ולספק דוגמאות הן של השתלות מוצלחות ולא מוצלחות על הפרשנות של תוצאות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן נועד להעריך את הכושר היחסי של HSCs התורם (מבחן) נגד ידוע המתחרה HSCs. המצב של תחרות מגביר את הרגישות היחסית של assay (סיכוי גבוהה יותר לזהות ירידות מתונות כושר תאי גזע) ומספק שליטה טכנית פנימית ליעילות של הקרנה והזרקה. עם זאת, זה לא אמור לשמש מדד מוחלט של כ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים RoxAnn Hétu-ארבור לסיוע עם עיצוב דמות והדגמה של הליכים. מחקר במעבדה נתמך על ידי פרסים מעבר מקרן קול, דיסקברי להעניק אין. 419226-2012 מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) וקרן קנדה עבור חדשנות (קרן מנהיגים CFI להעניק אין. 31,377). KMH הוא ג'וניור Chercheur-Boursier עבור Fonds דה משוכלל ונדיר קוויבק – Santé (FRQS).
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
Referências
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- . Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
