Trapianti competitivi per valutare staminali ematopoietiche cellule Fitness
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
Emopoiesi è un processo rigenerativo che assicura il rifornimento di cellule del sangue che sono state perse per infortunio, le radiazioni e la morte cellulare. Questo processo è garantita da cellule staminali ematopoietiche (HSC) che in gran parte si trovano nel midollo osseo. Inoltre, le cellule staminali ematopoietiche possono essere utilizzate a scopo terapeutico in malattie autoimmuni, neoplasie ematologiche e immunodeficienze 1. Vi è quindi la necessità di comprendere meglio i meccanismi che regolano la funzione HSC, tra cui la loro espansione proliferativa e la loro capacità di raggiungere e innestare il destinatario di midollo osseo dopo il trapianto. Anche se recenti studi hanno riportato diversi marcatori di superficie delle cellule, inclusi i membri della famiglia SLAM CD150 e CD48, per arricchire in modo prospettico CSE adulte e cellule staminali emopoietiche fetali di circa il 50% di purezza 2-4, la misura standard di riferimento per le CSE funzionale rimane un test in vivo ripopolamento a determinare la loro capacità di ristabilire sangue cproduzione ell in un host irradiato 5.
Il saggio ripopolamento clonale in vivo è stato inizialmente sviluppato da Till e McCulloch 6 e da allora è stata perfezionata e ampliata. Come originariamente definito, CSE garantire la produzione di globuli permanente attraverso l'auto-rinnovamento e la differenziazione. Il trasferimento di CSE in un destinatario irradiato permette quindi di valutare: la loro capacità di differenziare attraverso l'analisi delle diverse linee cellulari del sangue (linfociti T, linfociti B, granulociti, monociti) e la loro capacità di auto-rinnovamento attraverso il trapianto seriale. Il dosaggio di solito comporta il confronto della funzionalità e / o la quantità di due popolazioni di CSE, ad esempio, le cellule provenienti da due topi di differenti genotipi o cellule che sono state trattate o non trattate con differenti fattori che possono influenzare il mantenimento o l'espansione di CSE nella cultura. Donatore chimerismo, o il contributo di donatore di CSE trasferito to la produzione di globuli può quindi essere determinata mediante citometria di flusso analisi nel sangue periferico e nel midollo osseo utilizzando marcatori di superficie delle cellule o altri metodi che distinguerà cellule del donatore da parte del destinatario, o host. I marcatori più usati sono certamente i due alleli per il gene CD45 Ptprc o leucociti antigene 7 che abbiamo scelto per gli esempi forniti di seguito.
Il saggio ripopolamento clonale può essere competitivo o non competitiva. In un ambiente non competitivo, controllo e test CSE vengono trasferite in topi riceventi separati e il risultato per ogni tipo di cellula sarà indipendente dall'altro. In un ambiente competitivo, la funzione sia di prova e di controllo CSE è misurata contro una popolazione di concorrente CSE. Il protocollo qui descritto utilizza l'impostazione competitiva, ma può anche essere adattato per situazioni non competitivi. Entrambi gli approcci hanno i loro vantaggi e limitazioni, e li confronta in dettaglio neldiscussione. Abbiamo anche descrivere diversi approcci per garantire l'equità del numero di trapiantati CSE, è descritto come adattare il dosaggio per la quantificazione delle cellule staminali emopoietiche limitando test di diluizione (LDA), e fornire esempi di entrambi i trapianti di successo e insuccesso per l'interpretazione dei risultati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è stato progettato per valutare l'idoneità relativa del donatore (test) HSC contro concorrente noto CSE. La situazione di concorrenza aumenta la sensibilità relativa del test (più probabile per rilevare diminuzioni modeste palestra cellule staminali) e fornisce un controllo tecnico interno per l'efficacia di irradiazione e iniezione. Tuttavia, non dovrebbe essere usato come una misura assoluta di HTS fitness; una diminuzione della ricostituzione competitivo non significa automatic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Roxann Hétu-Arbour per l'assistenza con il disegno figura e dimostrazione delle procedure. La ricerca in laboratorio è stato sostenuto da un premio di transizione dalla Fondazione Cole, Discovery concedere alcuna. 419226-2012 dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC) e il Canada Foundation for Innovation (leader CFI Fondo concedere n. 31377). KMH è una Junior Chercheur-Boursier per il Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS).
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
Referências
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