Konkurransedyktige transplantasjoner skal vurdere stamcelle Fitness
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
Hematopoiesis er en regenerativ prosess som sikrer påfyll av blodceller som har gått tapt på grunn av skade, stråling og celledød. Denne prosessen er sikret av blodkreft stamceller (HSC) som i stor grad bor i voksen benmarg. I tillegg kan hematopoetiske stamceller kan brukes for terapeutiske formål i autoimmune forstyrrelser, hematologiske ondartede sykdommer og immunsvikt 1. Det er derfor et behov for å bedre forstå mekanismene som regulerer HSC funksjon, inkludert deres proliferative utvidelse og deres evne til å nå og innpode mottakeren benmarg etter transplantasjon. Selv om nyere studier har rapportert flere celleoverflatemarkører, inkludert SLAM familiemedlemmer CD150 og CD48, til prospektivt berike voksne HSCs og foster HSCs til omtrent 50% renhet 2-4, gull standard mål for funksjonell HSCs forblir en in vivo repopulating analyse for å bestemme deres evne til å reetablere blod cell produksjon i en bestrålt vert fem.
In vivo klonal repopulating analysen ble opprinnelig utviklet av Till og McCulloch 6 og har siden blitt videreutviklet og utvidet. Som opprinnelig definert, HSCs sikre livslang blodlegemer gjennom selvfornyelse og differensiering. Overføringen av HSCs inn i et bestrålt mottaker gjør det således mulig for oss å bedømme: deres evne til å differensiere ved analyse av de forskjellige blodcelle linjer (T-lymfocytter, B-lymfocytter, granulocytter, monocytter) og deres evne til selvfornyelse gjennom serietransplantasjon. Analysen vil vanligvis innebære sammenligning av funksjonaliteten og / eller kvantitet av to populasjoner av HSCs, for eksempel celler som kommer fra to mus med forskjellige genotyper eller celler som er blitt behandlet eller ubehandlet med ulike faktorer som kan påvirke den vedlikehold eller utvidelse av HSCs i kultur. Donor kimerisme, eller bidrag overført donor HSCs to blodceller kan deretter bli bestemt ved strømningscytometri-analyse i perifert blod og benmarg ved hjelp av celleoverflatemarkører eller andre metoder som vil skille donorceller fra mottakeren, eller vert. De mest brukte markører er sikkert de to alleler for genet Ptprc eller CD45 leukocytt antigen 7 at vi har valgt for eksemplene nedenfor.
Den klonal repopulation Analysen kan være enten konkurrerende eller ikke-konkurrerende. I en ikke-konkurrerende setting, blir kontroll- og test HSCs overført til separate resipientmus og resultatet for hver celletype vil være uavhengig av den andre. I et konkurranseutsatt miljø, er funksjonen av både test og kontroll HSCs målt mot en befolkning på konkurrent HSCs. Protokollen er beskrevet her bruker konkurranse innstillingen, men kan også tilpasses for ikke-konkurransesituasjon. Begge fremgangsmåter har sine fordeler og begrensninger, og vi sammenligner dem i detalj idiskusjon. Vi beskriver også ulike tilnærminger for å sikre egenkapitalen i antall transplanterte HSCs, forklare hvordan å tilpasse analysen for kvantifisering av HSCs ved å begrense fortynning analysen (LDA), og gi eksempler på både vellykkede og mislykkede transplantasjoner for tolkningen av resultatene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er beskrevet her er utformet for å evaluere den relative trenings av donor (test) HSCs mot kjente konkurrent HSCs. Situasjonen for konkurranse øker den relative følsomheten til analysen (større sannsynlighet for å detektere moderate reduksjoner i stamcelle kondisjon) og gir en intern kontroll for teknisk effekt av bestråling og injeksjon. Men det bør ikke brukes som et absolutt mål på HSC fitness; en nedgang i konkurranse oppløsning betyr ikke automatisk at HSCs ikke ville gjøre det bra i fravær …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for Roxann Hetu-Arbour for å få hjelp med figuren design og demonstrasjon av prosedyrene. Forskning i laboratoriet ble støttet av en overgang pris fra Cole Foundation, Discovery gi no. 419226-2012 fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC) og Canada Foundation for innovasjon (CFI Leaders Fund gi no. 31377). KMH er en Chercheur-Boursier Junior for Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS).
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
Referências
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- . Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
