Los trasplantes competitivos para Evaluar la aptitud de Células Madre Hematopoyéticas
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
La hematopoyesis es un proceso regenerativo que garantiza la reposición de las células de la sangre que se han perdido por lesión, la radiación y la muerte celular. Este proceso está garantizada por las células madre hematopoyéticas (HSC) que residen en gran parte en la médula ósea de adultos. Además, las células madre hematopoyéticas pueden usarse para fines terapéuticos en trastornos autoinmunes, neoplasias hematológicas e inmunodeficiencias 1. Por tanto, existe una necesidad de comprender mejor los mecanismos que regulan la función HSC, incluyendo su expansión proliferativa y su capacidad para alcanzar y injertar hueso receptor después del trasplante de médula. Aunque estudios recientes han informado de varios marcadores de la superficie celular, incluyendo los miembros de la familia SLAM CD150 y CD48, para enriquecer de forma prospectiva las HSC adultas y células madre hematopoyéticas fetales a aproximadamente el 50% de pureza 2-4, la medida estándar de oro para las CMH funcional sigue siendo un ensayo in vivo para repoblar determinar su capacidad para restablecer la sangre cell producción en un huésped irradiado 5.
El ensayo de repoblación clonal in vivo fue desarrollado inicialmente por Till y McCulloch 6 y desde entonces ha sido refinado y ampliado. Como se definió originalmente, las CMH asegurar la producción de glóbulos permanente a través de la auto-renovación y diferenciación. La transferencia de células madre hematopoyéticas en un receptor irradiado por lo tanto nos permite evaluar: su capacidad de diferenciarse a través del análisis de los diferentes linajes de células sanguíneas (linfocitos T, linfocitos B, granulocitos, monocitos) y su capacidad de auto-renovación a través del trasplante de serie. El ensayo sería por lo general implican la comparación de la funcionalidad y / o la cantidad de dos poblaciones de HSCs, por ejemplo, células procedentes de dos ratones de diferentes genotipos o células que han sido tratadas o no tratadas con diferentes factores que podrían influir en el mantenimiento o expansión de HSCs en la cultura. quimerismo de donantes, o la aportación del donante transferido HSC to la producción de glóbulos entonces se puede determinar por análisis de citometría de flujo en la sangre periférica y la médula ósea usando marcadores de superficie celular u otros métodos que distinguen las células del donante del receptor, o host. Los marcadores más utilizados son sin duda los dos alelos para el gen del antígeno CD45 PTPRC o leucocitos 7 que hemos elegido para los ejemplos que se proporcionan a continuación.
El ensayo de repoblación clonal puede ser competitivo o no competitivo. En un entorno no competitivo, las CMH control y de ensayo se transfieren a los ratones receptores separados y los resultados para cada tipo de célula será independiente de la otra. En un entorno competitivo, la función tanto de ensayo y control HSC se mide contra un competidor población de células madre hematopoyéticas. El protocolo descrito aquí utiliza la configuración competitivo, pero también puede ser adaptado para situaciones no competitivas. Ambos enfoques tienen sus ventajas y limitaciones, y vamos a compararlos con detalle en eldiscusión. También describimos diferentes enfoques para asegurar la equidad en el número de células madre hematopoyéticas trasplantadas, explicamos cómo adaptar el ensayo para la cuantificación de las HSC por ensayo de dilución limitante (LDA), y proporcionar ejemplos de ambos trasplantes exitosos y no exitosos para la interpretación de los resultados.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí está diseñado para evaluar la aptitud relativa de los donantes HSC (prueba) contra competidor conocido HSC. La situación de la competencia aumenta la sensibilidad relativa del ensayo (más probable detectar disminuciones moderadas en la aptitud de células madre) y proporciona un control técnico interno para la eficacia de la irradiación y la inyección. Sin embargo, no debe ser utilizado como una medida absoluta de la aptitud HSC; una disminución en la reconstitución competitiva no si…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a Roxann Hétu-Arbour para obtener ayuda con el diseño gráfico y la demostración de los procedimientos. La investigación en el laboratorio fue apoyado por un premio de la Fundación Transición Cole, Descubrimiento subvención no. 419226-2012 de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) y la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI Líderes fondo de donaciones. No 31377). KMH es un junior Chercheur-Boursier para el Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS).
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
Referências
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