Confronto di tre diversi metodi per la determinazione proliferazione cellulare in Breast Cancer linee cellulari
Summary
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Abstract
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Introduction
Il gene soppressore del tumore, p53, è un regolatore essenziale di un certo numero di processi cellulari, tra cui l'arresto del ciclo cellulare, apoptosi e senescenza 1. E 'responsabile del mantenimento della stabilità genomica, ed è quindi fondamentale per mantenere l'equilibrio di morte cellulare e la crescita delle cellule. Le mutazioni nel p53 sono comuni nel cancro e sono la principale causa di p53 l'inattivazione porta al cancro incontrollata proliferazione cellulare 2. È interessante notare che mutazioni in p53 rappresentano solo circa il 25% dei tumori al seno 3, suggerendo che altri meccanismi sono responsabili per la perdita della funzione di p53. Le isoforme p53 recentemente scoperte hanno dimostrato di essere sovraespresso in un certo numero di tumori umani, e possono modulare la funzione p53 4,5. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'isoforma p53, Δ40p53, è l'isoforma più altamente espresso nel cancro al seno, ed è significativamente upregulated in cellule del cancro al seno, rispetto al normale tiss adiacenteue 6. A seguito di questo, abbiamo stabilmente trasdotto linea di cellule di cancro al seno umano MCF-7 per iperespressione Δ40p53 con il Lego-IG2-puro + vettore (GFP +) 7. Queste cellule sono stati usati per indagare se elevata espressione Δ40p53 aumenta i tassi di proliferazione cellulare in cellule di cancro al seno.
Ci sono molti metodi diretti e indiretti di misurazione proliferazione cellulare di cellule coltivate in vitro 8,9. Questi possono essere eseguite sia come misurazioni in continuo nel tempo, o saggi come endpoint 10. I metodi convenzionali sono ancora utili, come ad esempio il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. Questo test è un basso costo e la misura diretta del numero di cellulare, ma non si basano su grandi conta delle cellule e la formazione altamente qualificata per ridurre al minimo errore e di grandi dimensioni standard di scostamenti dalle conta. La necessità di effettuare misurazioni compatibili con formati ad elevata capacità ha portato allo sviluppo di saggi multipozzetto-piastra. Questi test di luminescenza a base di misure il numero di cellule in base a un segnale di luminescenza che è proporzionale all'attività metabolica delle cellule 11,12. Più recentemente, l'introduzione di piattaforme di imaging ad alto contenuto ha consentito di nuovi strumenti che controllano la proliferazione cellulare, fornendo raccolta dati fenotipica quantitativa e qualitativa, e comprende una varietà di sistemi 13. Tutti questi metodi forniscono vie per misurare la crescita delle cellule, mediante saggi di misura o endpoint continue, e ciascuno possiedono una serie di vantaggi e svantaggi per quanto riguarda la sensibilità, throughput numero di campioni, e informazioni di cellule, ciascuno dei quali può essere pesato conseguenza seconda sulla domanda di ricerca.
Questo protocollo descrive tre metodi diversi per misurare la proliferazione cellulare in vitro, con ogni metodo utilizzando diverse gamme di sensibilità, riproducibilità e formati lastra multi-pozzetto. Questo protocollo prova a confrontare l'uso di un cha conteggio emocitometromber, un saggio luminescenza basato vitalità cellulare, e imager cellulare, nella misurazione della proliferazione cellulare su un corso di tempo 96 ore. Per fare questo, la crescita delle cellule trasdotte vettori (MCF-7-Lego) è stato confrontato con cellule trasdotte la sovraespressione Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), utilizzando tre diverse densità di cellule. La proliferazione cellulare è stata misurata ogni 24 ore per un massimo di 96 ore. Ogni metodo ha dimostrato di avere i propri vantaggi e svantaggi, e in funzione dello scopo dell'esperimento, ognuno ancora è un metodo utile per fornire informazioni sul tasso di proliferazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo sono state esaminate tre diversi metodi di misurazione proliferazione delle cellule in cellule in coltura. Ogni metodo era capace di misurazioni riproducibili e precise di proliferazione cellulare su 96 ore, ei risultati erano confrontabili tra ciascuno dei metodi testati (Figura 2 e 3). Sia il test di luminescenza-based e metodo di imaging cellulare prodotto i risultati più robusti, mostrando incremento lineare nella proliferazione cellulare dopo 96 ore (Figura 2b,</strong…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
Referências
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