Sammenligning af tre forskellige metoder til bestemmelse celleproliferation i brystcancercellelinier
Summary
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Abstract
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Introduction
Tumorsuppressorgenet, p53, er en væsentlig regulator af en række cellulære processer, herunder cellecyklusstop, apoptose og senescens 1. Den er ansvarlig for at opretholde genomisk stabilitet, og er derfor afgørende for at opretholde balancen i celledød og cellevækst. Mutationer i p53 er almindelige i kræft og er den væsentligste årsag til p53-inaktivering fører til ukontrolleret cancercelleproliferation 2. Interessant mutationer i p53 kun udgør omkring 25% af brystcancere 3, hvilket antyder, at andre mekanismer er ansvarlige for tab af p53-funktion. De nyligt opdagede p53-isoformer er blevet vist at være overudtrykt i en række humane cancere, og kan modulere p53-funktion 4,5. Vi har tidligere vist, at p53-isoform, Δ40p53, er den mest højt udtrykt isoform i brystcancer, og er signifikant opreguleret i brystcancerceller, sammenlignet med normale tilstødende Tissue 6. Efter dette, vi stabilt transduceret human brystcancer MCF-7 at overudtrykke Δ40p53 hjælp LEGO-IG2-puro + vektor (GFP +) 7. Disse celler blev anvendt til at undersøge, om høj Δ40p53 ekspression øger celleproliferation satser i brystcancerceller.
Der er mange direkte og indirekte metoder til måling celleproliferation af dyrkede celler in vitro 8,9. Disse kan udføres enten som kontinuerlige målinger over tid, eller som endpoint analyser 10. Konventionelle metoder er stadig nyttigt, såsom celletælling under anvendelse af et hæmocytometer. Dette assay er en billig og direkte mål for celletal, men det er afhængig af store celletal og højtuddannet træning for at minimere fejl og store standardafvigelser fra tællingerne. Behovet for at udføre målinger, der er kompatible med high-throughput formater har ført til udviklingen af flerbrøndspladens-plade-assays. Disse luminescens assays measure celletal baseret på et luminescerende signal, der er proportionalt med den metaboliske aktivitet af cellen 11,12. På det seneste har indførelsen af høje indhold imaging platforme tilladt for nye værktøjer, der overvåger celleproliferation samtidig give kvantitative og kvalitative indsamling fænotypiske data, og omfatter en række forskellige systemer 13. Alle disse metoder giver muligheder for at måle cellevækst, enten ved kontinuerlig måling eller endpoint assays, og hver har en række fordele og ulemper med hensyn til følsomhed, gennemløb af prøven tal og celleinformation, som alle kan vejes i overensstemmelse hermed afhængigt på forskning spørgsmål.
Denne protokol beskrives tre forskellige metoder til måling af celleproliferation in vitro, med hver metode benytte forskellige intervaller af følsomhed, reproducerbarhed og multi-brønds plade formater. Denne protokol, hvis formål at sammenligne anvendelsen af en hæmocytometertælling chamber, en luminescens-baserede celleviabilitetstest, og celle billeddanner, ved måling af celleproliferation over en 96 timer tidsforløb. For at gøre dette, blev væksten af vektor-transducerede celler (MCF-7-LeGO) sammenlignet med celler transduceret at overudtrykke Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), ved hjælp af tre forskellige celledensiteter. Celleproliferation blev målt hver 24 timer op til 96 timer. Hver metode viste sig at have sine egne fordele og ulemper, og afhængig af formålet med eksperimentet, hver stadig er en værdifuld metode til at give oplysninger om hastigheden for proliferation.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol tre forskellige metoder til måling af celleproliferation i dyrkede celler blev undersøgt. Hver metode var i stand til reproducerbare og nøjagtige målinger af celleproliferation over 96 timer, og resultaterne var sammenlignelige mellem hver af de testede metoder (figur 2 og 3). Både luminescens-assay og cell imaging metode producerede de mest robuste resultater, der viser lineære stigninger i celleproliferation efter 96 timer (figur 2b, c). Derudov…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
Referências
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. . Cell Biology. , 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. . Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).
- . . CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. . Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).
- Bastidas, O. . Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).
- Bastidas, O. . , (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. . Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).
