Sammenligning av tre forskjellige metoder for bestemmelse Cell Proliferation i brystkreftcellelinjer
Summary
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Abstract
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Introduction
Den tumorsuppressorgen, p53, er en viktig regulator av en rekke cellulære prosesser, inkludert cellesyklus-stans, apoptose og begynnende alderdom 1. Den er ansvarlig for å opprettholde genomisk stabilitet, og er derfor av avgjørende betydning for å opprettholde balanse mellom celledød og cellevekst. Mutasjoner i p53 er vanlig i kreft og er den viktigste årsaken til p53 inaktivering fører til ukontrollert kreftcelleformering 2. Interessant, mutasjoner i p53 bare står for ca 25% av brystkrefttilfeller 3, noe som tyder på at andre mekanismer er ansvarlig for tap av p53-funksjon. De nylig oppdagede p53-isoformer har vist seg å være overuttrykt i mange humane kreftformer, og kan modulere p53-funksjon 4,5. Vi har tidligere vist at p53 isoformen, Δ40p53, er de mest sterkt uttrykt isoform i brystkreft, og er signifikant oppregulert i brystkreftceller, sammenlignet med normal tilstøtende tissue 6. Etter dette, vi stabilt omformet den menneskelige brystkreft cellelinje MCF-7 til overuttrykker Δ40p53 hjelp av Lego-IG2-puro + vektor (GFP +) 7. Disse cellene ble brukt for å undersøke om høy Δ40p53 uttrykk øker celle spredning priser brystkreft celler.
Det finnes mange direkte og indirekte metoder for måling av celle proliferasjon av dyrkede celler in vitro 8,9. Dette kan utføres enten som kontinuerlige målinger over tid, eller som endepunkt analyser 10. Konvensjonelle metoder er fortsatt nyttig, for eksempel celletelling ved hjelp av et hemocytometer. Denne analysen er en lav kostnad og direkte mål på celle nummer, men det er avhengig av store celletall og dyktige opplæring for å minimere feil og store standardavvik fra tellingene. Behovet for å utføre målinger kompatible med high-throughput formater har ført til utvikling av multiwell-plate analyser. Disse luminescens-baserte analyser målere celleantall basert på et selvlysende signal som er proporsjonalt med den metabolske aktivitet av cellen 11,12. I den senere tid, har innføringen av høye innhold avbildnings plattformer er tillatt for nye verktøy som overvåker celleproliferasjon og samtidig gi kvantitative og kvalitative fenotypisk datainnsamling, og omfatter en rekke systemer 13. Alle disse metoder gir muligheter for å måle cellevekst, enten ved kontinuerlig måling eller endepunkt analyser, og hver har en rekke fordeler og ulemper med hensyn til følsomhet, gjennomstrømning av prøvenummer, og celleinformasjon, som alle kan bli veid følgelig avhengig på problemstillingen.
Denne protokollen beskriver tre forskjellige metoder for å måle celleproliferasjon in vitro, med hver fremgangsmåte som utnytter forskjellige områder av følsomhet, reproduserbarhet og multi-brønn plate-format. Denne protokollen var å sammenligne bruk av et hemocytometer telling chamber, en luminescens-baserte celleviabilitet analysen, og celle-imager, ved måling av celleproliferasjon i løpet av en 96 timers tids kurs. For å gjøre dette, ble veksten av vektor transduced celler (MCF-7-lego) sammenlignet med celler transduced å overuttrykker Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), ved hjelp av tre ulike celletettheter. Celleproliferasjon ble målt hver 24. time i opptil 96 timer. Hver metode ble funnet å ha sine egne fordeler og ulemper, og avhengig av det formål av forsøket, som hver fremdeles er en verdifull metode for å tilveiebringe informasjon om hastigheten av proliferasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen tre ulike metoder for å måle celleproliferasjon i dyrkede celler ble undersøkt. Hver metode var i stand til å reproduserbare og nøyaktige målinger av celleformering i løpet av 96 timer, og resultatene var sammenlignbare mellom hver av metodene som ble testet (figur 2 og 3). Både luminescens-baserte analysen og celleavbildningsmetode produserte de mest robuste resultater, viser lineær økning i celleproliferasjon etter 96 timer (figur 2b, c).…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
Referências
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. . Cell Biology. , 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. . Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).
- . . CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. . Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).
- Bastidas, O. . Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).
- Bastidas, O. . , (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. . Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).
