Introduction
조혈는 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)가 같은 대동맥 - 생식소 - Mesonephros로 배아 조혈 사이트와 태반 1,2의 다양한 존재 hemogenic 내피 세포를 싹 복잡한 발달 과정이다. 체외에서 배양 조혈 모세포에 대한 무능력이 과정의 깊이 분석뿐만 아니라 이러한 연구의 임상 응용 프로그램을 방지 할 수 있습니다. 이 제한을 회피하기 위해, 기존의 연구는 유도하기 위해 시도 조혈 모세포 드 노보 중 재 프로그래밍 미디어 4,5를 사용하는 다 능성 줄기 세포 (PSC를) 3, 또는 체세포에서 유도 소성 감독 분화의 차별화를 통해. 이 연구는, 그러나, 임상 적으로 안전 engraftable 세포를 생성하거나 결정적인 발달 조혈의 연구를 허용하지 않습니다 "접시를."
체세포 섬유 아세포의 페이지에서 야마나카 연구팀에 의해 설립 된 신규 작업을 유도 생성하는 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)전사 인자 (TF) 프로그래밍 세포 운명 6,7에 기반 과발현 전략을위한 프레임 워크를 rovides. 이 작품은 쉽게 얻을 체세포의 TF의 재 프로그래밍을 통해 선택의 세포 유형을 생성하기 위해 여러 분야의 연구자를 묻는 메시지가있다. 여기에 설명 된 프로그래밍 전략 목표는 마우스 체세포 시험 관내에서 인간 조혈을 연구하기 위해 환자 별 섬유 아세포를 재 프로그램 할 수있는 인간의 시스템에 이들 결과를 변환하는 목표와 TF 기반 프로그래밍 방법을 사용하여 세포로부터 hemogenic 처리를 유도하는 것이다 질병 모델 약물 테스트에 대한 환자 - 특정 혈액 제제를 생성하고, 줄기 세포 이식.
이러한 마우스 시스템의 적절한 프로그래밍을 위해 첫 번째 단계는 CD34 발현 내피 전구 세포 및 조혈의 공지 된 마커에 대한 판독 역임 리포터 라인을 개발 하였다. 이렇게하려면 huCD34-TTA와 TETO-H2BGFP 유전자 변형 마우스 라인 g을 사용 하였다enerate 이중 형질 전환 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs에)는, 이제 CD34 발기인 (8)의 활성화에 따라 녹색 형광 34 / H2BGFP를 나타낸다. 이는 조혈 명세서 및 개발하는 동안 다른 지점에서 요구되는 공지의 TF의 다양한 스크리닝시켰다. PMX retrovial 벡터 18과 TF를 시작으로 34 / H2BGFP MEFs에는 AFT024 기질 세포를 HSC는지지의 모든 요소 배양과 형질 도입 된, (34 / H2BGFP 마우스를 설명 문학 마이닝 및 이전에서 조혈 모세포를 유지 GFP 라벨의 프로파일 링을 통해 결정). 기자의 활성화를위한 TF가 최적의 설정이 확인 될 때까지 34 / H2BGFP 활성화의 검출 후, TF가이 연속적으로 재 프로그래밍 칵테일에서 제거되었습니다. 이 초기 화면 후에 인자하여 TFS의 발현을 제어 할 수 있도록하는 유도 DOX pFUW 벡터 시스템으로 옮겼다. 이 두 DOX 제어 시스템 (34 / H2BGFP 세포와 pFUW 유도 벡터)에서 MEFs에 호환되지 않는 때문에야생형 C57BL / 6 마우스가 필요했다. hemogenesis 진행하고 multilineage 클론 원성 전구 세포를 만들 수 있도록 적절한 미세 환경을 제공하는 것도 필요했다.
조혈 줄기 및 전구 세포로 (HSPCs)에 체세포를 재 프로그래밍을 시도하는 현재의 연구는 성공 9-11의 다양한 수준을 만났다. 현재까지, 마우스 및 장기 자기 갱신 다시 채우기 능력이 인간의 이식 가능한 HSPCs 모두의 발생과 TF들의 동일한 세트를 사용하여 달성되어 있지 않다. 이 프로토콜에서는 재현 된 MEFs에서 hemogenesis을 유도하는 미리 설정된 전략에 대한 상세한 설명을 제공한다. 우리는 TF가 (Gata2, Gfi1b, cFos를, 그리고 Etv6)의 최소한의 도입을 보여 발달 조혈 및 조혈 프로그래밍의 임상 응용 프로그램이 더 (12)를 연구 할 수있는 플랫폼을 제공 체외에서 복잡한 개발 프로그램을 선동 할 수있다.
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Protocol
윤리 문 : 마우스 세포주가 시내 산에서 의학의 아이칸 학교의 동물 관리 지침에 따라 유도하고, 호스트 기관 준수 수행해야합니다.
C57BL / 6 마우스 1. 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 분리
- 시간 제한 짝짓기 (13)을 설정합니다. 질 플러그가 가시화되면,이 날 0.5을 고려하십시오.
- 플러그 날짜에 연결 여성을 분리하고 임신을 확인하기 위해 하루 10 ~ 11에이를 확인.
- 날 13.5-14.5에서 CO를 통해 자궁 경부 전위 다음 2 흡입을 임신 여성 쥐를 안락사.
- 70 % 에탄올로 임신 한 여성의 배를 적시 중간 선 아래로 멸균 가위와 집게로 복강을 절개하고 수술 배아 (14)를 포함하는 자궁 뿔을 제거합니다. 나머지 복부 조직을 차단하면서 부드럽게 배아를 꺼냅니다.
주 : 각면에 4 약 8 배아를 복구 할 수 있습니다. - 자궁 시간 배치멸균 냉동 인산염 완충액 (PBS) 용액 5-10와 10cm 접시에 배아를 함유 orns.
- 멸균 가위와 집게로, 자궁 뿔을 따라 절개 배아를 들고 주머니를 분리 할 수 있습니다. PBS 냉각 살균의 5 ~ 10 ml의 새로운 10cm 접시에 주머니를 전송하고 얼음에 배치합니다.
- 멸균 냉장 PBS의 5 ~ 10 ml를 가진 새로운 10cm 접시에 주머니의 몇 가지를 놓습니다. 멸균 가위와 집게 부드럽게 배아를 관통 방지하기 위해 (너무 깊이 절단하지 않고) 주머니를 자르면 사용.
- 탯줄을 절단하여 태반에서 배아를 분리합니다.
- 냉장 PBS의 5 ~ 10 ml의를 포함하는 새로운 10cm 접시에 배아를 전송하고 나머지 해부를 완료하는 동안 얼음에 둡니다.
- 멸균 집게를 사용하여 배아 목을 벨. 조심스럽게 복부를 엽니 다 참수 지역에서 시작하여 멸균 가위와 집게를 사용하여 배아의 중간 선을 잘라. 위치는 t 아래 포셉그는 내장 기관 (심장, 간을 포함한 폐)와 15 그들을 다 쳤어요.
- 트립신 10 ㎖를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브에 가위와 집게 및 전송을 사용하여 작은 조각으로 남아있는 조직을 잘라.
- 피펫 위로 20 ~ 30 회 10ml를 피펫으로 다운 혼합 조직을 떼어 놓다합니다.
- 때때로 소용돌이, 45 분 동안 37 ° C를 물을 욕조에있는 조직과 트립신 믹스를 품어.
- 피펫 상하로 약 5 분 동안 10 ㎖ 피펫으로는 내용물을 혼합한다.
- 10 % 소 태아 혈청과 표준 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) (FBS)의 볼륨을 3 배 트립신 세포 추가 10 μg의 / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S), 1 mM의 L 글루타민 (L-GLUT)에서 10cm 요리 (~ 10 ㎖)과 합류 (2-4 일)까지 37 ° C에서 문화. 10cm 접시 당 1-2 배아에 대한 문화.
참고 : 플레이트 한번 동결 세포가 합류한다. 냉동 세포를 해동하고 2 회 이상 계대 될 수있다. 세포는 대안이 될 수해동 후 다음 한 번 더 이전에 동결에 2 회 분할합니다.
2. 바이러스 성 생산
- 10 % FBS, 형질 전환을위한 1 % P / S, 1 %의 L-GLUT 10 ML의 DMEM과 10cm 플레이트에서 293T 세포를 확장합니다.
- 2ml의 트립신를 Trypsinize 293T 세포를, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다 XG 300 15 ㎖의 튜브에 스핀 세포를 수집하고, 적절하게 플레이트 (10cm 접시 당 10 ㎖).
- 6 및 코팅 10cm 젤라틴의 씨앗 (PBS에서 0.1 % 젤라틴) 판 : 24 시간은 형질 전환 이전에, 293T 세포 1의 합류 10cm 접시를 분할합니다.
참고 : 바이러스 당 4 플레이트가 필요합니다.- 젤라틴의 코팅 플레이트, 코팅 10cm 플레이트의 바닥을 0.1 % 젤라틴 용액의 적어도 2를 가하여. 적어도 20 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 판에 셀을 추가하기 전에 대기음 오프 젤라틴.
- 15 ML 튜브에서 (84 μg의 플라스미드를 추가 예를 들어 Gata2, Gfi1b, cFos를, 또는 Etv6합니다 (pFUW-TETO의 VECT에 서브 클로닝16) 또는 FUW - M2rtTA 17), 84 μg의의 psPAX2, 42 μg의 pMD2.G. 물을 추가 (H 2 O) 2 ml의에 볼륨을 확인합니다. 각 요소에 대한 튜브를 준비합니다 (예. Gata2, Gfi1b, cFos를, Etv6와 FUW - M2rtTA).
- 선택된 유전자의 84 μg의 구성 2 ml의 혼합물을 포함하는 각 튜브에 2M CaCl2를 250 μl를 추가 (Gata2, Gfi1b, cFos를, Etv6 또는 FUW - M2rtTA) + 84 μg의 psPAX2 + 42 μg의 pMD2.G + H 2 O .
- 피펫 처치에 삽입 된 파스퇴르 피펫을 사용하여 릴리스는 2.25 ml의 DNA + H 2 O + 2 M CaCl2를 혼합물에 거품. 거품이 생성되는 바와 같이, 유리 피펫 대해 P1000의 팁을두고 서서히 배출이 100 mM의 N, N- 비스 (2- 히드 록시 에틸) 파스퇴르 피펫 1 다운 -2- 아미노 에탄 술폰산 (BES) 식염수 용액 한 번에 ml의.
- 적어도 15 분 동안 실온에서 배양 후드 내의 모든 튜브 부화.
주 : 4.25 ml의 혼합물 (지금의 DNA +의 H 2 O + 2M 염화칼슘 (2) - 혼합물, 흡인 미디어 오프 293T 판을 잠복하고 10 ML의 DMEM + 10 % FBS + 1 mM의 L 글루타민 + 25 나노 클로로퀸을 추가.
참고 :이 매체는 P / S가 포함되어 있지 않습니다. - 배양 적어도 15 분 후 (또는 293T 세포에 미디어를 변경 할 때까지), O + 2 M 염화칼슘 2 + BES 식염수 혼합물을 튜브 당 4 셀 플레이트 균등하게 분배의 293T 세포에 현명한 드롭 4.25 ml의 DNA +를 H 2를 추가 (플레이트 당 혼합물의 예보다 약간 많은 1 mL)을 첨가 하였다.
- 37 ° C에서 하룻밤 판 (O / N)를 품어.
- 24 시간 후 배양은 4 ㎖의 표준 DMEM (단계 1.15 참조) 모든 판에 미디어를 교체합니다.
- 지금부터 32 °의 C 배양기에서 세포를 유지합니다.
- 24 시간 단계 2.10 후, 별도의 50 ㎖ 튜브에 미디어를 수집합니다. 표준 DMEM 4 ㎖로 각 플레이트에서 수집 된 미디어를 교체합니다.
참고 : 수집 된 미디어 (16) 용액에 초기 튜브 혼합물 결과 당 4 판.- 에이따고 배양 12 시간 동일한 50 ㎖ 튜브에 다시 미디어를 수집하고 표준 DMEM의 또 다른 4 ㎖로 교체합니다.
- 배양 12 시간 후, 상기 미디어를 수집하고 동일한 50 ㎖ 튜브에 추가.
참고 : 각각의 튜브는 지금 바이러스를 포함하는 미디어의 약 48 ml에 포함해야합니다.
- 0.45 μM 저 단백 결합 필터를 통해 수집 된 바이러스, 첫 번째 필터 수집 된 미디어를 집중합니다.
- 바이러스 농도를 원심 분리 튜브 (한번에 약 16 mL)에 바이러스를 함유하는 여과 매체를 붓는다.
- 25 분 4 ° C에서 4,000 XG에 스핀과 흐름을 통해 제거합니다.
참고 : 농축 미디어와 바이러스의 작은 볼륨이 필터에 표시됩니다. - 필터에 남아있는 농축 미디어 + 바이러스 볼륨으로 필터링 된 바이러스 함유 미디어의 또 다른 16 ML을 추가하고 튜브를 반전하여 섞는다.
- 스핀 튜브 다시 25 분 및 폐기 흐름을 통해 4 ° C에서 4,000 XG에.
- 필터링 된 나머지 추가농축 미디어 + 바이러스 볼륨 집합은 필터에 남아있는 튜브를 반전시켜 혼합한다.
- (필터의 양에 따라) 10 ~ 20 분 동안 4 ° C에서 다시 한 번 4000 XG에 스핀 필터에 남아있는 농축 미디어 + 바이러스의 남은 양이 약 1 ml 인 것을 확인합니다. 농축 미디어 + 바이러스보다 1 ml를 필터에 남아있는 경우, 1 분 동안 4,000 × g으로 다시 회전하고 1 ㎖의 필터에 남아 때까지 반복한다.
- 1.5 ml의 튜브에 집중 바이러스의 200 μL 나누어지는 및 -80 ° C에서 동결 또는 즉시 사용할 수 있습니다.
3. MEF 재 프로그래밍
- 프리 코트 젤라틴이 잘의 전체 면적을 보장 PBS 웰 당 0.1 % 젤라틴 0.5 ml의 6 잘 접시. 37 ° C 배양기에 넣고 적어도 20 분 동안 품어. 인큐베이션 후, 플레이트를 제거하고, 젤라틴 대기음.
- 물론 당 25,000 세포의 밀도에서 표준 DMEM와 플레이트 MEFs에 (150,000 셀단계 3.1에서 젤라틴 6 웰 플레이트 (들)에) 6 웰 플레이트 당은 37 ° C 배양기에서 O / N을 해결 할 수 있습니다.
- Gata2, Gfi1b, cFos를, 그리고 Etv6의 혼합 (12.5 μL 각)을 50 μl의 M2rtTA를 혼합하고 나머지 50 μL하여 100 ㎕의 바이러스 칵테일을 준비합니다.
- MEFs에에서 대기음 매체와 8 μg의 / ㎖ hexadimethrine 브로마이드와 2 mL의 표준 DMEM를 추가합니다.
- 바이러스 칵테일 15 μL와 MEF 플레이트의 각 웰에 형질 도입하고, 37 ℃에서 O / N을 배양한다.
주 : 이것은 프로그래밍 프로세스의 일 0이다. - 1 일에서 배양의 16 ~ 20 시간 후, / ㎖ DOX 웰 당 1 μg의 보충 2 ml의 신선한 표준 DMEM으로 미디어를 교체합니다.
- 하이드로 코르티손 (10-6 M), 100 ng의 / 줄기 ㎖로 세포 인자 (SCF), 100 ng의 / ㎖ FMS 관련 티로신 키나아제 3 리간드 (Flt3L) 20 NG / ㎖ 인터루킨 -3 (IL-보충 조혈 배지를 준비 3) 20 NG / ml의 인터류킨 -6 (IL-6), 1 μg의 / ㎖ DOX.
- 4 일 aspirat에각각의 전자 매체 잘 잘 당 PBS 1 ml의 세포를 씻는다.
- 대기음 PBS는 웰 당 0.05 % 트립신 1 ㎖를 사용하여 세포를 해리하고 세포를 모은다.
- 단계 3.7에 설명 된 조혈 미디어 12 ㎖에 5 분에 resuspend 300 XG에, 혈구와 스핀 세포를 세어 0.1 % 젤라틴 코팅 된 플레이트에 6 웰 플레이트 당 60,000 세포를 플레이트 (2 ㎖ 당 잘 10,000 세포 당 잘 ).
- 문화의 기간 (35 ~ 36 일)에 대한 매 6 일 신선한 보충 조혈 문화 미디어와 미디어를 교체합니다.
- hemogenic 내피 또는 HSC와 같은 마커 유전자 발현의 인수를 확인하는 면역 염색 (12), FACS 분석 8,12, QRT-PCR (12), 및 mRNA의 염기 서열 (12)를 통해 중간 세포 또는 신흥 조혈 같은 세포를 분석 할 수 있습니다.
메틸 셀룰로오스 4. 태반 집계 및 콜로니 형성 단위 (CFU) 분석 실험
- 임신 C5에서 태반을 해부하다7BL / 6 마우스는 이전에 E12.5에서 18 설명과 얼음에 조직을 유지한다.
- 태반 해리 (19)를 시작하려면, 나는 20 % FBS와 PBS에서 2-5 ml의 0.2 % 콜라게나 유형에 태반 조직을 씻어 기계적으로 바늘을 통해 태반과 PBS를 계대하여 5 ML의 주사기에 장착 18G 바늘 해리 이상 3 회.
- 기계적 분리 후, 1.5 시간 동안 37 ° C에서 콜라게나 제 용액을 2-5 ml의 태반 세포를 유지한다.
- 20 ~ 25 G 바늘을 통과 세포는 더 기계적으로 태반 세포를 떼어 놓다 5 ml를 주사기에 여러 번 장착.
- 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 단일 세포 현탁액을 필터링합니다.
- 혈구와 세포를 계산하고 유사 분열 불 활성화 20 2,000 cGy의에서 조사.
- 10cm의 100 NG / ㎖ SCF 100 NG / ㎖ Flt3L 20 NG / ㎖의 IL-3, 20 NG / ㎖의 IL-6 및 10 NG / ㎖ 트롬 보포 이에 틴 (TPO)이 보충 된 조혈 배양 배지 10 ㎖를 추가 요리.
참고 : DOX는이 단계에서 필요하지 않습니다. - 이 액체 가스 인터페이스를 생성하고 따로 요리를 설정 떠있게 접시에 조혈 문화 매체에 직접 0.65 μm의 필터를 놓습니다.
- 단계 3.8-3.10에 설명 된대로 (단계 3.11에서 파생 된) 일 (25) 형질 도입 된 MEFs를 해리 단계 4.6에서 태반 집계 167,000 세포로 형질 도입 MEFs에의 33000 혼합 (1 : 6 비율).
- 300 X g에서 5 분 동안 단계 4.9에서 집계 18,21은 MEF 아래 첫 번째 스핀과 태반 세포 믹스를 생성합니다. 200 μL nonbevelled 피펫 팁으로 단일 세포 현탁액 그리기, 미디어를 기음과 P200 피펫을 사용하여 표준 DMEM의 30 ~ 50 μL에 펠렛 세포를 재현 탁.
- 파라핀 필름 피펫 팁을 흡장. 15 ML의 원심 분리기 튜브에 차단 팁을 놓고 끝 부분의 피복 말에 300 XG에 5 분간 때문에 펠렛 형태의 스핀 다운.
- 15 ML의주의 깊게 관과 장소에서 팁을 제거P200 피펫의 끝에 끝. 파라핀 필름을 폐기 단계 4.8에서 부동 필터에 세포 펠렛을 돌출.
참고 : 필터 당 최대 3 집계 접시입니다. - 문화 5 % CO 2와 37 ° C 4-5 일 동안 부동 0.65 μm의 필터에 집계.
- 세포를 해리 전체 태반으로 수행과 같은 프로토콜 (4.2-4.5 단계)에 따라, 셀 스크레이퍼로 집계 (필터 당 최대 3) 수집을 결합하고, 0.2 % 콜라게나 제와 소화.
- PBS 2-5 ml의 5 % FBS로 보충하여 분리 한 후, 응집체를 씻고 5 분 동안 300 XG에 세포를 스핀 다운.
- FBS, P / S, 또는 L-GLUT없이 DMEM 500 μL의 집계를 재현 탁. 이 재현 탁 500 μL를 취하여 10 신중 거품의 형성을 회피 TPO의 / ㎖ 겨 보충 된 3 ㎖의 1 % 메틸 매체에 추가. 3 35 X 10mm 비 처리 된 배양 접시에서이 혼합물 접시 같은 부피CFU (12)를 분석.
- 대조군으로, 문화는 단계 4.7-4.16에 상술 한 바와 같이 CFU 분석에 재 프로그램 MEFs에 4-5 일 장소를 혼합하지 않고 태반의 집계를 조사.
참고 :이 집계 혼자 식민지를 형성하지 않는다. - 수동 5 % CO 2와 37 ° C에서 문화의 10~14일 후 현미경으로 조혈 식민지를 계산합니다.
- Cytospin (22)는 단일 세포의 형태 학적 표현형을 보여 식민지를 들었다.
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Representative Results
조혈 다양한 배아 사이트에서 시작 복잡한 발달 과정이다. Hemogenic 내피 세포는이 사이트에있는 세포는 23 신진를 통해 조혈 모세포에 상승을 제공합니다. 이 과정은 현재 HSPC 확장 생체 또는 새로이 생성하여 역시 든 시험관 내에서 이들 세포를 수득하는 방법을 필요로 배양에서 조혈 모세포 또는 조혈 전구체를 배치하여 재생할 수 없다. 이 프로토콜은 MEFs에에 TF 과발현을 통해 이들 세포를 얻기 위해 시도하는 우리의 새로운 기술을 보여줍니다.
도 1은 전체 프로그래밍 과정을 나타낸다. MEF 생성 및 확장 한 후, 세포 Gata2, Gfi1b, cFos를, Etv6와 FUW - M2rtTA로 형질 도입된다. 젤라틴 코팅 된 플레이트에 DOX에 확장 노출 유전자의 활성화를 시작하는 3 일 후, 세포를 분해하고, 4 일에 분할 및보충 조혈 미디어에서 성장.
프로그래밍 매체와 장기간 배양 후 전달 후, 세포는 명확한 형태 학적 변화를 채택한다. 일에서 20 세포는 MEFs에 구별 내피 형태를 채택한다. 일에 또한 문화와 조혈 마커 SCA1 및 CD45 (그림 2)에 대한 긍정적 인 얼룩 (34 / H2BGFP MEFs에 사용시) GFP +있는 내피와 같은 중간에서 신흥 여러 라운드 조혈 같은 세포 35 결과. 이 염색이 세포가 hemogenic 유도 암시 표현형 마커를 얻을 수 있음을 보여줍니다. 또한 배양은 huCD34 리포터의 발현을 유지하면서, CD45을 발현하는 세포를 초래한다. 태반 집계 배양 세포 클론 원성 잠재력을 채택하고 다양한 조혈 형태학 및 폭발과 같은 세포 (그림 3)를 포함 메틸에 식민지를 생성하면.
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그림 1 : MEFs에있는 hemogenic 유도하기위한 전략. 다이어그램은 프로그래밍 과정과 그 안에 각 단계를 설명. 일반적인 프로그래밍 프로세스는 제 젤라틴 - 코팅 된 6- 웰 플레이트 내로 적절한 밀도로 분할 하였다 MEF 팽창을 수반한다. 세포를 Gata2, Gfi1b, cFos를, Etv6 및 FUW - M2rtTA의 칵테일 형질 도입된다. 세포 DOX 보충 표준 DMEM으로 배양한다. 하루에 4 세포를 트립신하고 6 웰 플레이트로 분할. 매 6 일 미디어가 변경되어 선택된 시간 지점에서 세포를 FACS, CFU 또는 유전자 발현 분석에 의해 분석 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2 : 전구에서 나오는 조혈 세포의 유도. SCA1 및 CD45에 대한 스테인드 34 / H2BGFP 양성 세포는 hemogenic 프로그램의 유도를 보여줍니다. (A)이 이미지는 재 프로그래밍 셀의 기본적인 시야 이미지로 GFP 형광을 동시에 CD45 및 SCA1 위해 염색 된 세포의 병합을 나타낸다. 편평 세포 인구의 서브 세트 만 SCA1, 내피 / hemogenic 마커를 표현하고, 오직 CD45, 범 조혈 마커 붉은 얼룩 이들 세포에서 나오는 조혈 같은 세포를 반올림. (B)이 이미지는 누가 뭐라고해도 SCA1 + 세포와 CD45 + 세포의 가까운 관계를 보여주는 브라이트 이미지없이 염색 및 GFP의 형광 세포를 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : CD45 + 조혈 세포의 생성. (A) Gata2, Gfi1b, cFos를, 그리고 Etv6로 형질 도입 (34) / H2BGFP MEFs에 약 12.7 %가 GFP + CD45 + 프로그래밍 35 일 이후입니다. 클리어 골수 모폴로지 및 폭발과 같은 세포는 CD45의 cytospin + 10-14일에 대한 메틸 셀룰로오스에 도금 분류 세포 후 H & E 염색 (B) 다음 볼 수 있습니다. 이 TF가이 최소한으로 전달 후 조혈 기능을 채택 재 프로그래밍 세포의 클론 multilineage 잠재력을 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
쉽게 달성 체세포에서 HSPCs 새로이 생성하는 것은 잠재적으로 시험관 내에서 조혈 및 기회를 연구 인간 시스템에이 기술을 적용하는 독특한 방법을 제공한다. 이 번역은 접시에 인간의 혈액 질환을 연구뿐만 아니라 새로운 치료제 또는 HSC 이식 수많은 장애를 치료 할 수있는 기회를 대상으로 약물 테스트 플랫폼과 유전자를 제공하기 위해 새로운 도구를 생성합니다. 필드에서, 최근의 연구는 프로그래밍 프로세스의 여러 가지 기능의 중요성을 보여주는 드 노보 HSPCs을 생성하는 능력을 확장하고있다. 다음은 시작 세포 인구 및 TF 칵테일의 선택뿐만 아니라 방법으로 배양 조건 (공동 문화의 틈새 시장) 및 보충 (사이토 카인, 작은 분자 등)을 크게 24-26를 재 프로그램의 효율성에 영향을 미칠를 포함한다. 여러 연구를 통해 이동하지 않고 인간 시스템 프로그래밍 기술을 적용이러한 과정에서 다 능성 중간, 27,28 바람직하지 않은 단계.
여기 능성 인자의 사용과 능성 중간체의 형성을 피하면서 발달 과정을 통해 체세포에서 HSC 유사 세포를 생성하기 위해 최초로 프로토콜이다. 생성 된 HSC와 같은 세포는 제 1 내지 제 여행 세포를 필요로하는 개발 프로세스를 통해 개발에 나타나는 hemogenic EHT 유사한 중간 내피. 내피 및 조혈 유전자 발현 정보를 포함하는 재 프로그래밍 내피 같은 중간체 형태 20 일째. HSC 유사 세포는 조혈 모세포에 매우 유사한 세포 표면 면역 표현형 유전자 발현 프로파일을 포함 및 CFU 분석에 적혈구 및 골수 콜로니를 생산할 수 35 일 이들 중간 세포로부터 나온다. 이것은 대부분의 다른 연구와는 달리,이 프로그램을 다시 만들 프로토콜은 체외에서 복잡한 개발 과정을 되풀이되었습니다, 제안 및 파마 수그것은 배아 조혈을 포함 조혈 및 혈액 학적 질병 프로세스의 추가 연구. 이러한 연구는 치료와 혈액에 존재 장애, 어떻게이를 위해 조혈를 조작하는 방법의 무리를 치료하는 방법에 대한 추가 연구를 할 수 있습니다. 이는 체외 질병 모델에서 설정하는 환자 맞춤형 섬유 아세포에서 hemogenic 프로그램을 유도하여 수행 할 수 있습니다. 이런 모델과 함께, 정상 및 질병 조혈 미세 해부 연구뿐만 아니라 관심있는 질병과 관련된 / 올바른 조혈 결함을 치료하는 약물 스크린 유전자 편집을 실시 할 수있다.
마우스 섬유 아세포를 사용하여 이러한 프로그래밍 프로세스의 다양한 유리한 특성들을 지원한다. 섬유 아세포 자체는 세포의 획득이 간단하고, 기증자 마우스에서 쉽게 구할 수 있습니다. 인간이 기술을 변환하는 것은 따라서 만 환자 별 혈액 제제 및 후속 세포 테의 취득을 환자의 피부 샘플을 필요로 할혈액 학적 질병을 치료 가능한 옵션 따끔. 또한 섬유 아세포 양 성적으로 억제 섬유 아세포 신원이 프로그래밍 프로토콜의 선택과 TF의 기능을 보여주는 매우 성적으로 별개의 조혈 세포에서, 그리고 또한 시작 셀 (29, 30)의 후생 유전 학적 메모리를 변경하여 hemogenic 프로그램 선동. 이러한 요소는 큰 관심이 될 것입니다 인간의 시스템에서 완벽하게 작동 조혈 세포를 생성하는 hemogenic 프로그램을 유도하는 경우 이식 연구는 아직보고, 이러한 유래 세포의 전체 multilineage 생착 기능을 설명하지 않지만.
이 프로토콜 내에서 여러 단계는 전달 이전 도금 셀의 수 및 전달에 사용되는 바이러스의 양의 프로그래밍시 어려움으로 수정 될 수있다. 최적의 결과는 VI의 전술 볼륨 6 웰 플레이트 (단계 3.2) 당 15 만 셀을 사용하여 볼 수 있었다RUS (3.3 및 3.5 단계), 그러나 더 많은 세포를 바이러스에 노출시 세포 사멸의 경우에 사용될 수있다. 마찬가지로 바이러스의 작은 부피를 설명 (즉, FACS 분석, CFU 분석 및 유전자 프로파일을 통해 확인할 수있다)로 사망 프로그래밍 진행 한, 문제가 될 셀해야 사용될 수있다. 즉 바이러스의 2.13-2.19 수율 적절한 양의 프로토콜의 나머지의 성공을 위해 필요한 단계를 보장한다. 단계 3.5-3.7도 중요하다, 세포의 성공적인 전달이 hemogenic 프로그램을 유도 중요하다. 형질 도입 된 세포의 웰 당 DOX의 적절한 양은 형질 전환 유전자 (따라서 자주 미디어 변경을 필요)의 발현을 확인하기 위해 일관성 신선한 유지되어야한다. 절대적으로 필요하지 않지만, DOX를 사용하여 어둠 속에서 세포 배양은 DOX 기능의 손실을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 형질 도입 후, 세포는 밀접 형태로 현미경으로 모니터링해야하고의를 위해 (예 FACS 및 CFU 분석 등) 다양한 분석 방법으로 분석uccessful 바이러스 전달 및 프로그래밍. 예상대로 다시 프로그램 세포는 적절한 프로그래밍의 가장 좋은 지표로 사용하기 위해 앞서 언급 한 분석 방법을 필요로하는, 많은 형태 학적 변화를 채택하지 않을 수 있습니다.
최근 연구에서 출발 세포 집단 31-33로 TF 칵테일 또는 섬유 아세포 등 Gata2 같은 프로그래밍이 프로토콜의 다른 기능을 이용하고있다. 이러한 방법론은 또한 프로그래밍 과정 프로그램 개발을 유도하는 것으로 보인다. 다른 전략은 9,10,25,26을 재 프로그램하는 동안 조혈 틈새 시장의 중요성을 보여 주었다. 프로그래밍에 도움이 모든 요소를 확인하는 것은 쉽게 달성 환자 맞춤형 세포에서 선의의 조혈 모세포를 생성 프로토콜을 개발하는 것이 필수적 일 것이다. 요약하면, 우리가 유도 Gata2, Gfi1b, cFos를, 그리고를 통해 마우스 섬유 아 세포에서 유도 발달 과정에서 HSC와 같은 세포를 생성하는 전략을 설명Etv6 과발현. 이 기술은 다른 발표 된 연구와 함께 임상 응용의 다양한 특정 환자 혈액 제제의 생성에 적합한 수, 인간 시스템으로 변환한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45 μM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18 G needles | BD | 305195 | |
| 20 G needles | BD | 305175 | |
| 25 G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65 μM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 mm x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
References
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