El diseño de dispositivos de microfluidos para el estudio de las respuestas celulares en la sección individual o Coexistencia Química / eléctrica / Shear Stress Los estímulos
Summary
Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
Abstract
Los dispositivos microfluídicos son capaces de crear un micro-entorno celular precisa y controlable de pH, temperatura, concentración de sal, y otros estímulos físicos o químicos. Se han utilizado comúnmente para estudios de células in vitro, proporcionando in vivo como entorno. Especialmente, la forma de respuesta de las células a los gradientes químicos, campos eléctricos, y esfuerzos de corte ha dibujado muchos intereses ya que estos fenómenos son importantes en la comprensión de las propiedades y funciones celulares. Estos chips de microfluidos pueden estar hechos de sustratos de vidrio, obleas de silicio, polímeros de polidimetilsiloxano (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA), sustratos o sustratos polietilentereftalato (PET). Fuera de estos materiales, los sustratos de PMMA son baratos y se pueden procesar fácilmente usando la ablación por láser y la escritura. Aunque algunos dispositivos microfluídicos se han diseñado y fabricado para generar múltiples, coexistiendo estímulos químicos y eléctricos, se consideró que ninguno de elloslo suficientemente eficiente en la reducción de las repeticiones experimentales, en particular con fines de detección. En este artículo, describimos nuestro diseño y fabricación de dos chips de microfluidos basada en PMMA para la investigación de las respuestas celulares, en la producción de especies reactivas de oxígeno y la migración, bajo estímulos de estrés individuales o coexistentes químicos / eléctricos / pernos de seguridad. El primer chip genera cinco concentraciones relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, y 1 en las regiones de cultivo, junto con un gradiente de tensión de cizalladura producida en el interior de cada uno de estas áreas. El segundo chip genera la misma concentración relativa, pero con cinco intensidades de campo eléctrico creado diferentes dentro de cada área de la cultura. Estos dispositivos no sólo proporcionan células con una, controlable microambiente precisa, pero también aumentan en gran medida el rendimiento experimental.
Introduction
En las células in vivo están rodeados por una variedad de biomoléculas, incluyendo la matriz extracelular (ECM), hidratos de carbono, lípidos, y otras células. Ellos funcionalizar respondiendo a los estímulos micro-ambientales tales como interacciones con ECM y las respuestas a los gradientes químicos de diferentes factores de crecimiento. Tradicionalmente, los estudios de células in vitro se llevan a cabo en placas de cultivo celular en el que el consumo de las células y los reactivos es grande y las células crecen en una estática (no circulante) medio ambiente. Recientemente, los dispositivos de micro-fabricada integrados con componentes fluídicos han proporcionado una plataforma alternativa para los estudios de células de una manera más controlable. Tales dispositivos son capaces de crear un micro-entorno precisa de los estímulos químicos y físicos y reducir al mínimo el consumo de las células y los reactivos. Estos chips de microfluidos pueden estar hechos de sustratos de vidrio, obleas de silicio, polidimetilsiloxano polímeros (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA) sustratos, o polyethylenetereftalato (PET) Sustratos 1-3. dispositivos basados en PDMS son transparentes, biocompatible, y permeable a los gases, haciéndolos adecuados para el cultivo celular a largo plazo y estudios. PMMA y PET sustratos son baratos y fáciles de ser procesados utilizando ablación por láser y la escritura.
Los dispositivos microfluídicos deben proporcionar células con un micro-entorno estable y controlable donde las células están sujetos a diferentes estímulos químicos y físicos. Por ejemplo, chips de microfluidos se utilizan para estudiar la quimiotaxis de las células. En lugar de los métodos tradicionales que emplean cámara de Boyden y capilar 4,5 estos dispositivos fluídicos miniaturizados pueden generar gradientes químicos precisos para el estudio de los comportamientos células '1,6,7. Otro ejemplo es el estudio de la migración direccional de células bajo campos eléctricos (EFS), fenómeno llamado electrotaxis. Se informó de comportamientos Electrotactic de células que estar relacionado con la regeneración del nervio 8, el desarrollo embrionario 9,y la cicatrización de la herida 10,11. Además, muchos estudios se han realizado para investigar la electrotaxis de diversos tipos de células incluyendo células de cáncer de 12,13, linfocitos 14,15, células de leucemia 11, y las células 16 madre. Convencionalmente, placas de Petri y cubiertas de vidrio se utilizan para construir cámaras electrotactic para la generación de los EF 17. Tales configuraciones simples plantean problemas de evaporación media y EFS imprecisas, pero pueden ser superados por los dispositivos de microfluidos de canales de fluidos cerrado, bien definidos 12,18,19.
Para estudiar sistemáticamente respuestas celulares en virtud de estímulos químicos y eléctricos precisos y controlables, sería de gran utilidad para el desarrollo de dispositivos de microfluidos capaces de proporcionar células con estímulos múltiples al mismo tiempo. Por ejemplo, Li et al. informó de un dispositivo de microfluidos basada en PDMS para la creación de una o coexistiendo gradientes químicos y los EF 20. Kao et al. devfugado un chip de microfluidos similar a modular la quimiotaxis de las células de cáncer de pulmón por EFS 6. Por otra parte, para aumentar el rendimiento, Hou et al. diseñado y fabricado un chip de doble-eléctrico-campo multicanal basados en PMMA para proporcionar células con 8 diferentes estímulos combinados, (2 puntos fuertes concentraciones de EF x 4 químicos) con 21. Para aumentar aún más el largo de y añadir el estímulo tensión de cizallamiento, hemos desarrollado dos dispositivos de microfluidos a base de PMMA para el estudio de las respuestas celulares en virtud de estímulos de estrés químicas simple o coexistiendo / eléctricos / cizallamiento.
Informado por Lo et al. 22,23, estos dispositivos contienen cinco canales de cultivo de células independientes que están sujetos a una circulación continua de fluidos, que imitan el sistema circulatorio in vivo. En el primer chip (chip química cizalla estrés o el chip CSS), cinco concentraciones relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, y 1 se generan en las regiones de cultivo, y un gradiente de tensión de cizallamiento es produced dentro de cada una de las cinco áreas de cultivo. En el segundo chip (chip-químico de campo eléctrico o el chip CEF), mediante el uso de un único conjunto de electrodos y 2 bombas de jeringa, cinco puntos fuertes EF se generan, además de cinco concentraciones químicas diferentes dentro de estas áreas de cultivo. cálculos y simulaciones numéricas se realizan para un mejor diseño y operan estos chips, y las células de cáncer de pulmón cultivadas dentro de estos dispositivos están sujetos a los estímulos individuales o coexistentes para la observación de las respuestas con respecto a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la tasa de migración, y la dirección de migración. Estos chips se demostraron ser, de alto rendimiento y fiables en la investigación de cómo las células responden a diversos estímulos ambientales micro-ahorro de tiempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
los chips basados en PMMA se confeccionan mediante ablación con láser y la escritura que son los métodos más fáciles y más baratos en comparación con los chips basados en PDMS que requieren más complicado litografía blanda. Después de diseñar un chip de microfluidos, la fabricación y el montaje se puede hacer en tan sólo 5 min. Hay algunos pasos críticos que se deberá prestar atención a en la realización del experimento. La primera es la cuestión "montaje". Los adaptadores deben p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
Referências
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
- Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
- Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
- Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
- Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
- Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
- Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
- Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
- Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
- Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
- Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
- Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
- Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
- Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
- Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
