تصميم الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة الردود الخليوي تحت واحدة أو تتعايش الكيميائية / الكهربائية / إجهاد القص المحفزات
Summary
Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
Abstract
أجهزة ميكروفلويديك قادرة على خلق الخلوية البيئة الصغيرة الدقيقة والسيطرة عليها من درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وتركيز الملح، وغيرها من المحفزات المادية أو الكيميائية. وقد تستخدم عادة لفي الدراسات المختبرية الخلية من خلال توفير في الجسم الحي مثل المناطق المحيطة بها. خصوصا، كيف إستجابة الخلايا لالتدرجات الكيميائية، المجالات الكهربائية، واجهادات القص وضعت العديد من المصالح حيث أن هذه الظواهر ليست مهمة في فهم خصائص ووظائف الخلوية. هذه الرقائق الموائع الدقيقة يمكن أن تكون مصنوعة من ركائز الزجاج، رقائق السليكون، ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) البوليمرات، البولى (PMMA) ركائز، أو بولي إيثيلين تيرفثالات ركائز (PET). من هذه المواد، ركائز PMMA رخيصة ويمكن معالجتها بسهولة باستخدام الاستئصال بالليزر والكتابة. على الرغم من أن عدد قليل من أجهزة ميكروفلويديك وقد تم تصميم وملفقة لتوليد متعددة، تتعايش المحفزات الكيميائية والكهربائية، اعتبر أيا منهافعالة بما فيه الكفاية في الحد من تكرار التجربة، خاصة لأغراض الفحص. في هذا التقرير، وصفنا لدينا تصميم وتصنيع اثنين من رقائق ميكروفلويديك القائم على PMMA للتحقيق في الاستجابات الخلوية، في إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية والهجرة، تحت الكيميائية / الكهربائية محفزات الإجهاد / القص واحدة أو التعايش. الشريحة الأولى يولد خمسة تركيزات النسبية من 0، 1/8، 1/2، 7/8، و 1 في المناطق الثقافة، جنبا إلى جنب مع التدرج إجهاد القص التي تنتج داخل كل من هذه المجالات. الشريحة الثانية يولد نفس التركيزات النسبية، ولكن مع خمسة مختلفة شدة المجال الكهربائي التي تم إنشاؤها ضمن كل منطقة ثقافة. هذه الأجهزة لا توفر سوى الخلايا مع دقة، يمكن السيطرة عليها البيئة الصغيرة، ولكن أيضا زيادة كبيرة في الإنتاجية التجريبية.
Introduction
في محاصرون خلايا الجسم الحي من قبل مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية (ECM)، والكربوهيدرات، والدهون، والخلايا الأخرى. أنها functionalize من خلال الاستجابة للمؤثرات البيئية الصغيرة مثل التفاعل مع ECM والردود على التدرجات الكيميائية من عوامل النمو المختلفة. تقليديا، يتم إجراء دراسات الخلايا في المختبر في أطباق زراعة الخلايا حيث استهلاك الخلايا والكواشف كبير وتنمو الخلايا في ثابت (غير المتداولة) البيئة. في الآونة الأخيرة، وقد وفرت الأجهزة ملفقة الصغيرة تتكامل مع مكونات الموائعية منصة بديلة للدراسات الخلية بطريقة أكثر يمكن السيطرة عليها. هذه الأجهزة قادرة على خلق بيئة صغيرة دقيقة من المحفزات الكيميائية والفيزيائية مع التقليل من استهلاك الخلايا والكواشف. ويمكن إجراء هذه الرقائق ميكروفلويديك من ركائز الزجاج، رقائق السليكون، ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) البوليمرات، البولى (PMMA) ركائز، أو polyethylenetereالفثالات (PET) ركائز 1-3. الأجهزة القائمة PDMS-شفافة وحيويا، ومنفذة للغازات، مما يجعلها مناسبة لزراعة الخلايا على المدى الطويل والدراسات. PMMA وPET ركائز هي رخيصة وسهلة لتتم معالجتها باستخدام الاستئصال بالليزر والكتابة.
يجب أن أجهزة ميكروفلويديك توفر الخلايا مع الدقيقة بيئة مستقرة وتحت السيطرة حيث الخلايا تخضع للمؤثرات الفيزيائية الكيميائية المختلفة و. على سبيل المثال، تستخدم رقائق ميكروفلويديك لدراسة الكيميائي للخلايا. بدلا من الطرق التقليدية التي تستخدم بويدن غرفة والشعرية 4،5 هذه الأجهزة الموائعية المنمنمة يمكن أن تولد التدرجات الكيميائية الدقيقة لدراسة السلوكيات الخلايا 1،6،7. مثال آخر هو دراسة هجرة الخلايا الاتجاه تحت المجالات الكهربائية (EFS)، وهي ظاهرة اسمه انجذاب كهربي. تم الإبلاغ عن السلوكيات Electrotactic من الخلايا لتكون ذات صلة تجديد الأعصاب 8، 9 التطور الجنيني،والتئام الجروح 10،11. وأجريت العديد من الدراسات للتحقيق في انجذاب كهربي من مختلف أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا سرطان 12،13، 14،15 الخلايا اللمفية، خلايا سرطان الدم 11، والخلايا الجذعية 16. تقليديا، يتم استخدام أطباق بتري ونظارات غطاء لبناء غرف electrotactic لتوليد التماثلية 17. هذه الاجهزة بسيطة تثير مشاكل التبخر المتوسطة والتماثلية غير دقيقة، ولكن يمكن التغلب عليها عن طريق أجهزة ميكروفلويديك قنوات الموائعية المغلقة، واضحة المعالم 12،18،19.
لدراسة منهجية الاستجابات الخلوية تحت مؤثرات الكيميائية والكهربائية الدقيقة، يمكن السيطرة عليها، فإنه سيكون ذا فائدة كبيرة لتطوير أجهزة ميكروفلويديك قادرة على توفير الخلايا مع مؤثرات متعددة في نفس الوقت. على سبيل المثال، لي وآخرون. ذكرت جهاز ميكروفلويديك القائم PDMS لخلق واحدة أو تتعايش التدرجات الكيميائية والتماثلية 20. كاو وآخرون. ديفهربت شريحة ميكروفلويديك مماثل لتعديل الكيميائي للخلايا سرطان الرئة بواسطة التماثلية 6. وعلاوة على ذلك، لزيادة الإنتاجية، هوى وآخرون. تصميم وملفقة شريحة متعددة المزدوج والكهربائية والميدانية القائمة على PMMA لتوفير الخلايا مع 8 مختلف المحفزات مجتمعة، (تركيز 2 نقاط القوة EF × 4 الكيميائية) يجري 21. لزيادة في جميع أنحاء وإضافة حافز إجهاد القص، وضعنا جهازين ميكروفلويديك القائم على PMMA لدراسة الاستجابات الخلوية تحت واحدة أو تتعايش الكيميائية / الكهربائية محفزات الإجهاد / القص.
رواه لو وآخرون 22،23، وهذه الأجهزة تحتوي على خمس قنوات الثقافة خلية مستقلة تخضع لالمستمر فلويديك التدفق، ومحاكاة في الجسم الحي الدورة الدموية. في الشريحة الأولى (المادة الكيميائية القص رقاقة الإجهاد أو رقاقة CSS)، وخمسة تركيزات النسبية من 0، 1/8، 1/2، 7/8، و 1 يتم إنشاؤها في المناطق الثقافة، والتدرج إجهاد القص هو الم Ùدائرة الهندسة المدنية داخل كل مجال من مجالات الثقافة الخمسة. في الشريحة الثانية (رقاقة الكيميائية الكهربائية الحقل أو رقاقة مركز دراسات الحدود)، وذلك باستخدام مجموعة واحدة واحدة من الأقطاب الكهربائية ومضخات 2 حقنة، يتم إنشاء خمسة نقاط القوة EF بالإضافة إلى خمسة التركيزات الكيميائية المختلفة داخل هذه المناطق الثقافة. يتم تنفيذ العمليات الحسابية العددية ومحاكاة لتصميم أفضل وتعمل هذه الرقائق، وخلايا سرطان الرئة مثقف داخل هذه الأجهزة تخضع للمؤثرات واحدة أو التعايش لرصد استجاباتها فيما يتعلق إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، معدل الهجرة، واتجاه الهجرة. وأثبتت هذه الرقائق لتكون، الإنتاجية العالية والأجهزة الموثوقة للتحقيق في كيفية استجابة الخلايا لمختلف المحفزات الدقيقة البيئية لتوفير الوقت.
Protocol
Representative Results
Discussion
هي ملفقة رقائق القائم على PMMA باستخدام الاستئصال بالليزر والكتابة التي هي طرق أرخص وأسهل بالمقارنة مع رقائق مقرها PDMS والتي تتطلب الطباعة الحجرية الناعمة أكثر تعقيدا. بعد تصميم رقاقة ميكروفلويديك، تصنيع وتجميع ويمكن أن يتم ضمن مسافة 5 دقائق. هناك بعض الخطوات الحاسمة ا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
Referências
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
- Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
- Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
- Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
- Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
- Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
- Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
- Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
- Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
- Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
- Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
- Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
- Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
- Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
- Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
