एकल या coexisting रासायनिक / इलेक्ट्रिकल / कतरनी तनाव उत्तेजनाओं के तहत सेलुलर प्रतिक्रियाएँ के अध्ययन के लिए microfluidic उपकरणों डिजाइनिंग
Summary
Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
Abstract
Microfluidic उपकरणों पीएच, तापमान, नमक एकाग्रता, और अन्य शारीरिक या रासायनिक उत्तेजनाओं की एक सटीक और चलाया सेलुलर सूक्ष्म वातावरण बनाने में सक्षम हैं। वे आमतौर पर परिवेश की तरह विवो में प्रदान करके इन विट्रो सेल के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। विशेष रूप से, कैसे कोशिकाओं रासायनिक ढ़ाल, बिजली के क्षेत्रों, और कतरनी तनाव के लिए प्रतिक्रिया कई हितों तैयार की गई है के बाद से इन घटनाओं सेलुलर गुण और कार्यों को समझने में महत्वपूर्ण हैं। इन चिप्स microfluidic ग्लास substrates, सिलिकॉन वेफर्स, polydimethylsiloxane (PDMS) पॉलिमर, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, या polyethyleneterephthalate (पीईटी) substrates के बनाया जा सकता है। इन सामग्रियों में से PMMA substrates सस्ते होते हैं और आसानी से लेजर पृथक और लेखन का उपयोग कर कार्रवाई की जा सकती। हालांकि कुछ microfluidic उपकरणों के लिए डिज़ाइन किया गया है और गढ़े, कई पैदा रासायनिक और बिजली उत्तेजनाओं coexisting के लिए, उनमें से कोई भी विचार किया गया थापर्याप्त प्रयोगात्मक दोहराता है, स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए विशेष रूप से कम करने में कुशल है। इस रिपोर्ट में, हम प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन और प्रवास में सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए हमारे डिजाइन और दो PMMA आधारित microfluidic चिप्स के निर्माण का वर्णन है, एक या coexisting रासायनिक / इलेक्ट्रिकल / कतरनी तनाव उत्तेजनाओं के तहत। पहली चिप के पांच रिश्तेदार सांद्रता उत्पन्न 0, 1/8, 1/2, 7/8, और संस्कृति के क्षेत्रों में 1, एक साथ एक कतरनी तनाव ढाल इन क्षेत्रों में से प्रत्येक के अंदर उत्पादन के साथ। दूसरी चिप ही रिश्तेदार सांद्रता उत्पन्न करता है, लेकिन पाँच अलग अलग बिजली के क्षेत्र में प्रत्येक संस्कृति के क्षेत्र के भीतर बनाया ताकत के साथ। इन उपकरणों को न केवल एक सटीक, सूक्ष्म चलाया पर्यावरण के साथ कोशिकाओं को प्रदान लेकिन यह भी बहुत प्रयोगात्मक throughput वृद्धि हुई है।
Introduction
इन विवो कोशिकाओं बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम), कार्बोहाइड्रेट, वसा, और अन्य कोशिकाओं सहित biomolecules की एक किस्म से घिरे हैं। वे इस तरह के और विभिन्न विकास कारकों की रासायनिक ढ़ाल के लिए ईसीएम के साथ बातचीत प्रतिक्रियाओं के रूप में सूक्ष्म पर्यावरण उत्तेजनाओं का जवाब देने से functionalize। परंपरागत रूप से, इन विट्रो सेल के अध्ययन सेल संस्कृति बर्तन में आयोजित की जाती हैं, जहां कोशिकाओं और अभिकर्मकों की खपत बड़ी है और कोशिकाओं को एक स्थिर में बढ़ने (गैर-घूम) पर्यावरण। हाल ही में, सूक्ष्म गढ़े fluidic घटकों के साथ एकीकृत उपकरणों के लिए एक अधिक चलाया रास्ते में सेल के अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक मंच प्रदान किया है। इस तरह के उपकरणों रासायनिक और भौतिक उत्तेजनाओं की एक सटीक सूक्ष्म वातावरण बनाने के दौरान कोशिकाओं और अभिकर्मकों की खपत को कम करने में सक्षम हैं। (PDMS) पॉलिमर, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, या polyethylenetere ये microfluidic चिप्स ग्लास substrates, सिलिकॉन वेफर्स, polydimethylsiloxane का बनाया जा सकताphthalate (पीईटी) 1-3 substrates। PDMS आधारित उपकरणों, पारदर्शी biocompatible, और गैसों के लिए प्रवेश के योग्य हैं, उन्हें लंबे समय तक सेल संस्कृति और अध्ययन के लिए उपयुक्त बना रही है। PMMA और पीईटी substrates सस्ता और आसान लेजर पृथक और लेखन का उपयोग संसाधित किया जाना है।
Microfluidic उपकरणों के लिए एक स्थिर और चलाया सूक्ष्म वातावरण जहां कोशिकाओं विभिन्न रासायनिक और शारीरिक उत्तेजनाओं के अधीन हैं के साथ कोशिकाओं को प्रदान करना चाहिए। उदाहरण के लिए, चिप्स microfluidic कोशिकाओं की chemotaxis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके बजाय पारंपरिक तरीकों को रोजगार कि Boyden कक्ष और केशिका 4,5 इन छोटी fluidic उपकरणों कोशिकाओं के व्यवहार के अध्ययन के लिए 1,6,7 सटीक रासायनिक ढ़ाल उत्पन्न कर सकते हैं। एक अन्य उदाहरण बिजली क्षेत्र (EFS), एक घटना नामित electrotaxis के तहत 'कोशिकाओं दिशात्मक प्रवास का अध्ययन करने के लिए है। कोशिकाओं के व्यवहार Electrotactic सूचित किया गया तंत्रिका उत्थान 8, 9 भ्रूण विकास से संबंधित हो,और चिकित्सा 10,11 घाव। और कई अध्ययनों, 14,15 लिम्फोसाइटों, कैंसर की कोशिकाओं 12,13 सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के electrotaxis जांच करने के लिए प्रदर्शन किया गया है ल्यूकेमिया कोशिकाओं 11, और 16 कोशिकाओं स्टेम। पारंपरिक, पेट्री डिश और कवर चश्मा EFS 17 पैदा करने के लिए electrotactic कक्षों के निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है। इस तरह के सरल setups मध्यम वाष्पीकरण और imprecise EFS की समस्या पैदा, लेकिन वे संलग्न, अच्छी तरह से परिभाषित fluidic चैनलों 12,18,19 की microfluidic उपकरणों से दूर किया जा सकता है।
योजनाबद्ध तरीके से सटीक, चलाया हुआ रासायनिक और बिजली उत्तेजनाओं के तहत सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, यह बहुत अच्छा microfluidic एक ही समय में कई उत्तेजनाओं के साथ कोशिकाओं को उपलब्ध कराने में सक्षम उपकरणों को विकसित करने का होगा। उदाहरण के लिए, ली एट अल। एकल बनाने या रासायनिक ढ़ाल और EFS 20 coexisting के लिए एक PDMS आधारित microfluidic युक्ति की सूचना दी। काओ एट अल। देवEFS 6 से फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं की chemotaxis मिलाना के लिए एक समान microfluidic चिप भाग गई। इसके अलावा, throughput, Hou एट अल बढ़ाने के लिए। बनाया गया है और 8 अलग संयुक्त उत्तेजनाओं, किया जा रहा है (2 एफई ताकत एक्स 4 रासायनिक सांद्रता), 21 के साथ कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए एक PMMA आधारित मल्टीचैनल-दोहरे बिजली क्षेत्र चिप गढ़े। आगे बढ़ाने के लिए और पूरे कतरनी तनाव प्रोत्साहन जोड़ने के लिए, हम एक या coexisting रासायनिक / इलेक्ट्रिकल / कतरनी तनाव उत्तेजनाओं के तहत सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए दो PMMA आधारित microfluidic उपकरणों का विकास किया।
लो एट अल। 22,23 द्वारा रिपोर्ट, इन उपकरणों के पांच स्वतंत्र सेल संस्कृति निरंतर fluidic बहने के अधीन चैनल, विवो संचार प्रणाली की नकल उतार होते हैं। पहली चिप (रासायनिक-कतरनी तनाव चिप या सीएसएस चिप), 0 से पांच रिश्तेदार सांद्रता, 1/8, 1/2, 7/8, और 1 में संस्कृति क्षेत्रों में उत्पन्न कर रहे हैं, और एक कतरनी तनाव ढाल है उत्पादों होगापांच संस्कृति क्षेत्रों में से प्रत्येक के अंदर ced। दूसरी चिप (रासायनिक बिजली के क्षेत्र चिप या CEF चिप), इलेक्ट्रोड का एक ही सेट और 2 सिरिंज पंप का उपयोग करके, पांच एफई ताकत इन संस्कृति क्षेत्रों के भीतर पांच विभिन्न रासायनिक सांद्रता के अलावा उत्पन्न कर रहे हैं। संख्यात्मक गणना और सिमुलेशन बेहतर डिजाइन करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं और इन चिप्स काम करते हैं, और फेफड़ों के कैंसर के इन उपकरणों के अंदर संवर्धित कोशिकाओं प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन के संबंध में अपनी प्रतिक्रिया के अवलोकन के लिए एकल या coexisting उत्तेजनाओं (आरओएस) के अधीन हैं, प्रवास दर, और प्रवास दिशा। इन चिप्स समय की बचत, उच्च throughput और विश्वसनीय उपकरणों की जांच कैसे कोशिकाओं विभिन्न सूक्ष्म पर्यावरण उत्तेजनाओं का जवाब के लिए होने का प्रदर्शन कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
PMMA आधारित चिप्स लेजर पृथक और लेखन जो सस्ता और आसान तरीके हैं जब PDMS आधारित चिप्स जो अधिक जटिल नरम लिथोग्राफी की आवश्यकता की तुलना में उपयोग कर निर्मित कर रहे हैं। एक microfluidic चिप डिजाइनिंग के बाद, निर्माण और व?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
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