Summary

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

Published: August 13, 2016
doi:

Summary

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Abstract

Mikroakışkan cihazlar pH, sıcaklık, tuz konsantrasyonu, ve diğer fiziksel ya da kimyasal uyarılara bir hassas ve kontrollü hücresel mikro çevrede oluşturma yeteneğine sahiptir. Bunlar genellikle çevresi gibi in vivo sağlayarak in vitro hücre çalışmaları için kullanılmıştır. bu olayların hücresel özellikleri ve işlevleri anlamada önemli olduğundan özellikle hücreleri kimyasal geçişlerini, elektrik alanlar ve kayma gerilmeleri cevabını kaç ilgi çekmiştir. Bu mikro-akışkan yongaları, cam substratlar silikon gofret, polidimetilsiloksan (PDMS) polimer, polimetilmetakrilat (PMMA) alt-tabakalar ya da polietilentereftalat (PET) alt tabakaların yapılabilir. Bu malzemelerin dışında, PMMA substratlar ucuz ve kolay bir şekilde lazerle ablasyonu ve yazma kullanılarak işlenebilir. Birkaç mikroakışkan cihazları, birden üreten kimyasal ve elektrik uyarılarının eşlik için tasarlanmış ve imal edilmiş olmasına rağmen, bunların hiçbiri kabul edildiYeterince tarama amacıyla özellikle deneysel tekrarlar, azaltılmasında etkili. Bu yazıda, tek veya eşlik eden kimyasal / elektrik / kayma gerilmesi uyaranlara altında, reaktif oksijen türlerinin üretimi ve göç, hücresel yanıtları araştırmak için iki PMMA esaslı mikroakışkan cips bizim tasarım ve imalat açıklar. İlk çip beş göreli konsantrasyonları üretir 0, 1/8, birlikte bu alanların her birinde içinde üretilen bir kayma gerilmesi gradyan ile kültür bölgelerinde 1/2, 7/8, ve 1. İkinci çip ancak her kültür alanı içinde oluşturulan beş farklı elektrik alan güçlü olan, aynı bağıl konsantrasyonlarını oluşturur. Bu cihazlar sadece hassas, kontrollü mikro-çevre hücreleri sağlamak değil, aynı zamanda büyük ölçüde deneysel verimi arttırmak değil.

Introduction

In vivo hücreler ekstrasellüler matriks (ECM), karbonhidratlar, lipidler ve diğer hücreleri dahil biyomoleküllerin çeşitli çevrili içinde. Bunlar çeşitli büyüme faktörleri kimyasal degradeler için ECM ile etkileşimler ve yanıtları mikro çevresel uyaranlara yanıt vererek işlerlik. Hücre ve reaktiflerin tüketimi büyüktür ve hücre ortamı (dışı dolaşım) statik yetiştiği Geleneksel olarak, in vitro hücre çalışmaları Hücre kültür tabaklarında yürütülmektedir. Son zamanlarda, akışkan bileşenleri ile entegre mikro fabrikasyon cihazlar daha kontrol edilebilir bir şekilde hücre çalışmaları için alternatif bir platform haline gelmiştir. Bu tür cihazlar hücreleri ve reaktifler tüketimini en aza indirirken, kimyasal ve fiziksel uyaranlar kesin bir mikro-ortam yaratma yeteneğine sahiptir. Bu mikro-akışkan yongaları, cam substratlar silikon gofret, polidimetilsiloksan yapılabilir (PDMS) polimerleri, polimetilmetakrilat (PMMA) alt-tabakalar ya da polyethylenetereftalat (PET) 1-3 alt tabakalar. PDMS tabanlı cihazlar uzun vadede hücre kültürü ve çalışmalar için uygun hale, şeffaf biyolojik olarak uyumlu ve gazlara karşı geçirgendir. PMMA ve PET yüzeyler, lazer ablasyon ve yazma kullanılarak işlenecek ucuz ve kolaydır.

Mikroakışkan cihazlar hücreleri, farklı kimyasal ve fiziksel uyarıcılara maruz kalan bir sabit ve kontrollü mikro ortam hücreleri sağlamalıdır. Örneğin, mikro-akışkan fiş hücrelerinin kemotaksisini incelemek için kullanılır. Bunun yerine Boyden odası ve kılcal 4,5 bu minyatür akışkan cihazlar hücrelerin davranışlarını 1,6,7 çalışmak için kesin kimyasal degradeler oluşturabilir istihdam geleneksel yöntemlerin. Başka bir örnek elektrik alanları (EFS), bir fenomen adlı electrotaxis altında hücrelerin yönlü göç incelemektir. Hücrelerin Electrotactic davranışları, rejenerasyon 8, embriyonik gelişme 9 ile ilişkili olduğu bildirilmiştirve 10,11 yara iyileşmesi. Ve birçok çalışma, 14,15 lenfositlerin, kanser hücreleri 12,13 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin electrotaxis araştırmak için lösemi hücrelerini 11 yapıldı ve hücreler 16 kök edilmiştir. Geleneksel olarak, petri ve örtücü camlar EF'lerini 17 üretilmesi için electrotactic odaları oluşturmak için kullanılır. Böyle basit kurulumları orta buharlaşma ve kesin olmayan EF sorunlarını teşkil, ama onlar kapalı, iyi tanımlanmış akışkan kanalların 12,18,19 ve mikroakışkan cihazlar aşılabilir.

sistematik hassas, kontrol kimyasal ve elektriksel uyaranlar altında hücresel yanıtları incelemek için, aynı anda birden fazla uyaranlara hücreleri sağlayabilen mikroakışkan cihazlar geliştirmek için büyük kullanım olacaktır. Örneğin, Li ve diğ. Tek oluşturma veya kimyasal geçişlerini ve EF'lerini 20 coexisting için PDMS tabanlı mikroakışkan cihaz bildirdi. Kao ve diğerleri. devEF 6 akciğer kanser hücrelerinin kemotaksisini modüle benzer bir mikroakışkan çip eloped. Ayrıca, verimlilik, Hou ve ark artırmak için. tasarlanmış ve 8 farklı kombine uyaranlara olmanın (2 EF güçlü x 4 kimyasal konsantrasyonları) 21 ile hücreleri sağlamak için bir PMMA esaslı çok kanallı-çift-elektrik alan çip fabrikasyon. ayrıca boyunca artırmak ve kayma gerilmesi uyaran eklemek için, biz tek veya eşlik eden kimyasal / elektrik / kayma gerilmesi uyaranlara altında hücresel yanıtları incelemek için iki PMMA esaslı mikroakışkan cihazlar geliştirdi.

Lo ve ark. 22,23 tarafından bildirilen bu cihazlar in vivo dolaşım sistemini taklit eden sürekli akışkan akan tabi beş bağımsız hücre kültürü kanalları içerir. birinci çip (kimyasal kayma gerilimi çip veya CSS çip) beş göre 0 konsantrasyonları, 1/8, 1/2, 7/8 ve 1, kültür bölgelerinde üretilen ve bir kesme stresi gradyanı edilir süredenBeş kültür alanlarının her birinin içine ced. ikinci çip elektrot tek bir seti ve 2 şırınga pompaları kullanılarak (kimyasal-elektrik alan çip ve CEF çip) olmak üzere beş EF güçlü, bu kültür alanları içinde beş farklı kimyasal konsantrasyonlar ilave olarak oluşturulur. Sayısal hesaplamalar ve simülasyonlar daha iyi bir tasarım uygulandı ve bu yongaları işletmek ve bu cihazların içinde kültüre akciğer kanseri hücreleri reaktif oksijen türlerinin üretimi ile ilgili yanıtları gözlemlemek için tek veya eşlik eden uyaranlara (ROS) tabidir, göç oranı, ve göç yönü. Bu çipler zaman tasarrufu hücreleri çeşitli mikro-çevresel uyaranlara nasıl tepki araştırmak için, yüksek verim ve güvenilir cihazlar olduğu gösterilmiştir.

Protocol

1. Chip Tasarım ve İmalat Beraberlik desenleri ticari yazılım 24 kullanılarak PMMA yüzeyleri ve çift taraflı bantlar üzerinde kesip çıkartılacak. Beş kültür alanlarında (Şekil 1A ve 1B) her ucunda değişen genişliğe sahip bir "Noel ağacı" desen çizmek, kimyasal konsantrasyonlar ve kayma gerilmeleri etkilerini incelemek için. Tuz köprüleri için iki tane daha akışkan kanalları (Şekil 2A ve <…

Representative Results

Kimyasal kayma gerilme (CSS) Çip CSS çip, iki çift taraflı bantlar ile birlikte bağlı üç PMMA levhalar, kalınlık 1 mm, her biri, kalınlığı 0.07 mm (Şekil 1A ve 1B) her biri yapılır. "Noel ağacı" yapısı 0 beş nispi konsantrasyonları üretir 1/8, beş kültür alanlarında 1/2, 7/8, ve 1. hacim akış hızını, akışkan viskozitesi ve akışkan kanalın boyutu …

Discussion

PMMA esaslı cips daha karmaşık yumuşak litografi gerektiren PDMS tabanlı çipleri ile karşılaştırıldığında daha ucuz ve daha kolay yöntemlerdir lazer ablasyon ve yazma kullanılarak imal edilir. mikroakışkan çip tasarladıktan sonra, imalat ve montaj sadece 5 dakika içinde yapılabilir. dikkat deneyi gerçekleştirirken ödenmesi gerektiğini bazı kritik adımlar vardır. İlk "birleştirme" bir konudur. Adaptör çipin en üst tabakaya düzgün yapıştırılmış olmalıdır. Çok fazla uy…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Cell culture medium
Trypsin Gibco 25300-054 detach cell from the dish
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10082147 Cell culture medium
10-cm cell culture Petri dish Nunc 150350 Cell culture
Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629 Cell Counting Equipment
PMMA Customized Customized Microfluidic chip
Adaptor Customized Customized Microfluidic chip
0.07/0.22 mm double-sided tape  3M 8018/9088 Microfluidic chip
Low melting point agarose Sigma A9414 Salt bridge
2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate Sigma D6883 Intracellular ROS measurement
Indium tin oxide (ITO) glass Merck 300739 Heater
Proportional-integral-derivative controller  JETEC Electronics Co. TTM-J4-R-AB Temperature controller
Thermal coupler TECPEL TPK-02A Temperature controller
CO2 laser scriber Laser Tools & Technics Corp. ILS2 Microfluidic chip fabrication
Syringe pumps New Era NE-300 Pumping medium and chemicals into the chip
Power supply Major Science  MP-300V Supplying direct currents
Inverted microscope Olympus CKX41 Monitoring cell migration
Inverted fluorescent microscope Nikon TS-100 Monitoring cell migartion and fluorescencent signals
DSLR camera Canon 60D Recording bright-field images 
CCD camera Nikon DS-Qi1 Recording fluorescent images 
super glue 3M Scotch 7004 Attaching adaptors to PMMA substrates
AutoCAD Autodesk Inc. Designing microfluidic chips
DMSO Sigma D8418 Dissolving DCFDA
ImgeJ National Institutes of Health Quantifying fluorescent intensities and cell migration

Referências

  1. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
  2. Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  4. Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
  5. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
  6. Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
  7. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
  8. Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
  9. Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
  10. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  11. Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
  12. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  13. Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
  14. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
  15. Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
  16. Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
  17. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
  18. Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
  19. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  20. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  21. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
  22. Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
  23. Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
  24. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
  25. Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
  26. Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
  27. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  28. Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
  29. Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
  30. Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
  31. Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
  32. Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
  33. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
check_url/pt/54397?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Chou, T., Sun, Y., Hou, H., Wu, S., Zhu, Y., Cheng, J., Lo, K. Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli. J. Vis. Exp. (114), e54397, doi:10.3791/54397 (2016).

View Video