تدفق الفرز وإكسوم التسلسل من خلايا ريد-ستيرنبرغ من الليمفاوية الكلاسيكي هودجكين
Summary
هنا، نحن تصف مجتمعة التدفق الخلوي سايتوميتريك الفرز والمدخلات المنخفضة، الجيل المقبل من بروتوكول بناء مكتبة مصممة لإنتاج عالية الجودة، بيانات كاملة إكسوم من خلايا هودجكين ريد-سترنبيرغ (هرس) من سرطان الغدد الليمفاوية الكلاسيكي هودجكين (تشل).
Abstract
خلايا هودجكين ريد-ستيرنبرج من سرطان الغدد الليمفاوية الكلاسيكي هودجكين توزع بشكل ضئيل ضمن خلفية من الخلايا الليمفاوية الالتهابية وعادة ما تشكل أقل من 1٪ من كتلة الورم. المواد المشتقة من الورم السائب يحتوي على محتوى الورم في تركيز غير كاف للتوصيف. لذلك، يتم وصف مضان تنشيط خلية الفرز باستخدام ثمانية الأجسام المضادة، وكذلك الجانب إلى الأمام مبعثر، هنا كوسيلة للفصل بسرعة والتركيز مع آلاف عالية النقاء من الخلايا هرس من الورم لدراسة لاحقة. وفي الوقت نفسه، لأن البروتوكولات القياسية لتسلسل إكسوم عادة ما تتطلب 100-1،000 نانوجرام من الحمض النووي المدخلات، والتي غالبا ما تكون مرتفعة جدا، حتى مع تدفق الفرز، ونحن نقدم أيضا الأمثل، وانخفاض المدخلات بروتوكول بناء مكتبة قادرة على إنتاج عالية الجودة البيانات من أقل من 10 نانوغرام من الحمض النووي المدخلات. هذا المزيج قادر على إنتاج مكتبات الجيل التالي مناسبة لالتقاط التهجين لكامل هزوم الطعوم أو أكثر تركيزا لوحات المستهدفة، كما هو مطلوب. تسلسل إكسوم من الخلايا هرس، عند مقارنته مع خلايا صحية أو T إنتراتومور، يمكن التعرف على التعديلات الجسدية، بما في ذلك الطفرات، والإدراج والحذف، ونسخة نسخ التعديلات. هذه النتائج توضح البيولوجيا الجزيئية للخلايا هرس وقد تكشف عن سبل للعلاج المخدرات المستهدفة.
Introduction
وقد أدى التقدم في علم الجينوم السرطان نتيجة لتسلسل الجيل القادم إلى اختراقات كبيرة في تحديد الأهداف العلاجية وفي التكهن للعديد من الأورام الدموية وغير الدموية. يتم إدخال استراتيجيات جديدة للعلاج الفردي على أساس التعديلات الجينية محددة في العديد من أنواع الورم (مراجعة في المراجع 1 ، 2 ). على الرغم من التقدم الملحوظ في علم الجينوم اللمفاوية، الجينوم من الخلايا هرس الورم في هيمجكين الكلاسيكيه الكلاسيكي (تشل) لم تستكشف. وقد عرقلت التحقيقات من ندرة الخلايا هرس الأورام ضمن المكروية رد الفعل، مما يجعل من الصعب عزل السكان خلية هرس النقي 3 .
وقد تم تطوير طريقة لعزل خلايا هرس قابلة للحياة من الأورام الأولية من قبل فروم وآخرون. 4 ،المرجع "> 5 ، 6. يستخدم الأسلوب كوكتيل ثمانية الأجسام المضادة، والتي تتكون من CD30، CD15، CD40، CD95، CD45 CD20، CD5، و CD64، لتحديد لا لبس فيه خلايا هرس من تعليق الورم تشل.باستخدام هذه المنهجية، ونحن قادرة على عزل ما لا يقل عن 1000 خلية هرس قابلة للحياة من تعليق خلية جديدة أو مجمدة من خزعات الورم تتكون من ما لا يقل عن 10 7 خلايا (حوالي 10 ملغ من الأنسجة)، والنقاء أكبر من 90٪ عن طريق تحليل التدفق الخلوي ويقدر أن يكون أقل من 80٪ من قبل التحليل الجيني إكسوم من عشر حالات متتالية.
لقد صقلنا تقنية عزل الخلايا الخلوية الخلوية التي خففت كثيرا من العملية، مما يسمح للعزلة السريعة لآلاف الخلايا القابلة للحياة من الخلايا الجذعية الأولية من الأورام تشل الأولية 7 . لقد استخدمنا هذه التقنية لإنتاج ما يعتقد أنه أول تسلسل إكسوم كامل من الخلايا السرطانية في الحالات الأولية من سرطان الغدد الليمفاوية هودجكين. دراساتنا تثبت ثه جدوى عالية الإنتاجية والدراسات على نطاق الجينوم من الحالات تشل الفردية وأدت بالفعل إلى التعرف على التعديلات الجينية الجديدة مع إمكانية تفسير جوانب تشل المرضية.
كما طورنا خط أنابيب للاستفادة من الحمض النووي المستخرج للدراسات الجينية عالية الإنتاجية. من أجل تحقيق نتائج موثوقة من عدد قليل من 1000 خلايا هرس فرزها (الحد الأدنى التي تم الحصول عليها من الحالات المتسلسلة)، كما قمنا بتطوير تعديل الجيل القادم من الحمض النووي إجراء بناء مكتبة 8 التي سمحت لنا لزيادة كفاءة ربط المحول وتوليد مكتبات قسم الحمض النووي دون تضخيم المفرط. هذا الأسلوب يسمح لتحليل العينات السريرية الروتينية والكشف عن الطفرات المتكررة والتغيرات الكروموسومية 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
التطبيقات أو الاتجاهات المستقبلية بعد اتقان هذه التقنية
هذا العمل يسمح تسلسل إكسوم من العينات التي تحتوي على 10 نانوغرام على الأقل من الحمض النووي. في السياق السريري، هذا الحد يستبعد معظم عينات طموح إبرة غرامة بسبب عدم ك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل تطوير هذا المشروع المشروع من قبل قسم علم الأمراض والطب المخبري من كلية طب وايل كورنيل. ونحن نعترف برنامج التدريب المؤسسي الثلاثي في علم الأحياء الحاسوبية والطب للتمويل الجزئي. نود أن نشكر العلماء الذين تقاسموا وقتهم ومعرفتهم معنا، وخاصة ماريك أبيل؛ دان بورغيس؛ إيوانكا كوزاريوا؛ تشاد لوكلار؛ والجميع من المؤسسة الأساسية لعلم الجينوم في كلية طب وايل كورنيل، بما في ذلك جيني تشانغ، وشياوبو (شون) ليانغ، ودونغ شو، وي تشانغ، وهويمين شانغ، وتاتيانا باتسون، وتوو تشانغ.
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
References
- Abrams, J. National Cancer Institute’s Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome medicine. 7, 80 (2015).
- Matsuki, E., Younes, A. Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma. Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).
- Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting. Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).
- Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity. Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).
- Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications. Advances in hematology. 2011, 387034 (2011).
- Reichel, J., et al. Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).
- Kozarewa, I. A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA. PLoS ONE. 7 (3), e32617 (2012).
- Brunicardi, F. C. . Schwartz’s Principles of Surgery. , (2014).
- Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. Handbook of Experimental Immunology. 2, (1996).
- Sanders, M. E. Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin’s cell line L428. Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).
- Biosciences. . FACSAria II User’s Guide. Part No. 644832, Revision A. , (2009).
- . Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216 Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216 (2017)
- Roche Nimblegen. . SeqCap EZ Library SR User’s Guide ver. 4.1. , (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Saunders, C. T. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).
- Dobin, A. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- . DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0 Available from: https://omictools.com/dnacopy-tool (2013)
