इन अध्ययनों में, हम उपन्यास, नवजात, murine हृदय पुनर्योजी अध्ययन में इस्तेमाल के लिए scaffolds के लिए कार्यप्रणाली प्रदान करते हैं।
The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.
दिल की विफलता आम और घातक है। यह एक प्रगतिशील बीमारी है जो दिल है, जो अंगों को रक्त प्रवाह को बाधित और शरीर unmet की चयापचय की मांग के पत्तों की कमी आई है सिकुड़ना में यह परिणाम है। यह अनुमान है कि 5.7 करोड़ अमेरिकियों को दिल की विफलता है और यह संयुक्त राज्य अमेरिका में 9 अस्पताल में भर्ती का प्राथमिक कारण है। संयुक्त राज्य अमेरिका में दिल की विफलता में रोगियों के उपचार के सामूहिक लागत प्रति वर्ष 9-10 $ 300 अरब डॉलर से अधिक है। अंत में मंच दिल की विफलता के लिए ही निश्चित चिकित्सा ओर्थोटोपिक हृदय प्रत्यारोपण है। हर साल, यह अनुमान है कि 100,000 से अधिक दाता दिलों में संयुक्त राज्य अमेरिका के 1-2 हृदय प्रत्यारोपण प्रक्रिया के लिए आवश्यक हैं। दाताओं की सीमित संख्या के कारण, केवल लगभग 2,400 प्रत्यारोपण अमेरिका में हर साल 2 प्रदर्शन कर रहे हैं। जाहिर है, इस अंग की कमी के रूप में अन्य रणनीतियों transplanta के लिए अतिरिक्त अंगों का निर्माण करने के लिए आवश्यक हैं जरूरतों को संबोधित कियाtion और, आदर्श, इन अंगों के रूप में तो अस्वीकृति और जीवन भर प्रतिरक्षादमन से संबंधित जटिलताओं से बचने के लिए ऑटोलॉगस होगा।
स्तनधारी वयस्क cardiomyocytes चोट पर एक सीमित पुनर्योजी क्षमता का प्रदर्शन है, लेकिन हाल ही में सबूत से पता चलता है कि स्तनधारी नवजात दिलों चोट 5-8 के बाद एक उल्लेखनीय पुनर्योजी क्षमता बनाए रखने के लिए। विशेष रूप से, आंशिक शल्य लकीर के बाद, एक पुनर्योजी खिड़की जन्म और प्रसव के बाद दिन के बीच की खोज की गई है 7. इस पुनर्योजी अवधि fibrotic निशान की कमी है, neovascularization के गठन, epicardium से एन्जियोजेनिक कारकों की रिहाई, और cardiomyocyte प्रसार 5-8 की विशेषता है 11। समय की यह पुनर्योजी खिड़की एक bioartificial दिल के विकास के लिए सामग्री का एक उपन्यास स्रोत के रूप में नवजात दिल प्रयोग करने के लिए क्षमता प्रदान करता है।
बाह्य मैट्रिक्स महत्वपूर्ण संकेतों cardiomyocyt बढ़ावा देने के लिए प्रदान करने के लिए जाना जाता हैई प्रसार और विकास। नवजात और वयस्क matrices 12 और उनके उत्थान को बढ़ावा देने की क्षमता में अणुओं की उपलब्धता में स्पष्ट मतभेद 13 का पता लगाया गया है। Decellularized वयस्क matrices कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है सेलुलर repopulation के लिए एक ईसीएम पाड़ और एक bioartificial दिल की पीढ़ी प्रदान करने के लिए। इन अध्ययनों, और स्टेम सेल प्रौद्योगिकियों में नई खोजों, तेजी से आगे बढ़ रहे हैं, वहीं कई बाधाओं को अभी तक पूरा किया जाना है। उदाहरण के लिए, मैट्रिक्स दीवार में मैट्रिक्स के मूल संरचना, सेलुलर एकीकरण के संरक्षण में सीमाओं, और क्षमता प्रसार और विकास के सभी सीमा समर्थन करने के लिए इस दृष्टिकोण की सफलता। बेहतर पुनर्योजी गुण नवजात दिल के लिए जिम्मेदार माना गया है, इस तरह के एक ऊतक का उपयोग करने के व्यावहारिक पहलुओं को अपने अन्वेषण सीमित है।
नवजात दिल का प्रदर्शन किया पुनर्योजी क्षमता के आधार पर, हम एक विकसित करके उपन्यास matrices विकसित किया हैपी 3 माउस दिल के लिए decellularization की तकनीक। पी 3 दिल इन अध्ययनों के लिए चुना गया था के रूप में यह हृदय उत्थान की खिड़की के भीतर है, जैसा कि पहले 6 चुना गया लेकिन दिल फसल, decellularize और recellularize करने के लिए काफी बड़ी है। इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए एक नवजात माउस दिल से एक मैट्रिक्स बनाने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन है। हमारे अध्ययन करते हुए ईसीएम की संरचनात्मक और प्रोटीन अखंडता को बनाए रखने के लिए एक मिनट, नवजात दिल decellularizing की व्यवहार्यता के लिए सबूत प्रदान करते हैं। हम यह भी mCherry व्यक्त cardiomyocytes के साथ इस हृदय ईसीएम recellularize करने की क्षमता प्रदर्शित और हम Recellularization निम्नलिखित विभिन्न हृदय मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए इन cardiomyocytes की जांच की है। यह तकनीक एक bioartificial दिल के विकास के लिए एक नवजात मैट्रिक्स की श्रेष्ठता के परीक्षण के लिए अनुमति देगा।
दिल के दोहराया perfusions पर इस तकनीक की निर्भरता एक दिल का आवेश के परिहार के एक सफल परिणाम के एक महत्वपूर्ण घटक बना देता है। कदम 2.2-2.6 में दिल की प्रारंभिक कैथीटेराइजेशन, कदम 2.8-2.14 के बीच समाधान के परिवर्तन के लिए, …
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge Ms. Cynthia DeKay for the preparation of the figures.
1. Materials For Mouse Heart Isolation | |||
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
#5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
2. Materials For Decellularization | |||
Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
22g x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
22 x 1 g needle | BD | 305155 | or equivalent |
PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended |
1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
1X Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
3. Materials For DNA Quantitation | |||
Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30U/mg activity |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
MgCl*6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
4. Method for fixation and sectioning of tissue. | |||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
5. Method for tissue histology | |||
Cryomolds 10 x 10 x 5mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating. | |||
HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
HEPES (1M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
50 mL tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |