Évaluation rapide et spécifique de l'halogénation peroxydase Activité dans les échantillons de sang enrichie en leucocytes
Summary
This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.
Abstract
Dans cet article, un protocole pour l'enrichissement rapide et homogène des leucocytes à partir de petits échantillons de sang entier est décrit. Cette procédure est basée sur la lyse hypotonique des érythrocytes et peut être appliqué à des échantillons humains, ainsi que le sang d'origine non humaine. Le petit volume d'échantillon initial d'environ 50 à 100 ul rend cette méthode applicable au prélèvement de sang périodique de petits animaux de laboratoire. En outre, l'enrichissement des leucocytes est réalisé en quelques minutes et avec des efforts matériels faibles en ce qui concerne les produits chimiques et de l'instrumentation, ce qui rend cette méthode applicable dans les environnements de laboratoire multiples.
La purification normalisée des leucocytes est combiné avec un procédé hautement sélectif de coloration pour évaluer l' activité de la peroxydase halogénation des peroxydases de l' hème, la myéloperoxydase (MPO) et éosinophile peroxydase (EPO), à savoir la formation d'hypochloreux et de l' acide hypobromeux (HOCl et HOBr). Alors que FTU est fortement exprimé dans neutrophils, immunitaire de type cellulaire le plus abondant dans le sang humain, ainsi que dans les monocytes, l'enzyme lié à l'EPO est exclusivement exprimé dans les éosinophiles. L'activité d'halogénation de ces enzymes est traitée en utilisant la fluorescéine presque HOCl- et HOBr colorant spécifique aminophényl (CSA) et le substrat de la peroxydase primaire du peroxyde d'hydrogène. Lors de l'analyse ultérieure de cytométrie de flux de toutes les cellules positives à la peroxydase (neutrophiles, les monocytes, les éosinophiles) sont distinguables et leur activité de peroxydase d'halogénation peuvent être quantifiés. Etant donné que la coloration du CSA peut être combiné avec l'application de marqueurs de surface cellulaire, ce protocole peut être étendu pour traiter spécifiquement les sous-fractions de leucocytes. Le procédé est applicable à la détection de HOCl et HOBr la production à la fois chez l'homme et dans les leucocytes de rongeurs.
Étant donné le rôle immunologique largement et diversement discuté de ces produits enzymatiques dans les maladies inflammatoires chroniques, ce protocole peut contribuer à une meilleure compréhension de lapertinence immunologique de peroxydases hème leucocytaires dérivés.
Introduction
Les leucocytes polynucléaires (PMN, également appelés granulocytes et monocytes) représentent les composants cellulaires importants du système immunitaire inné du 1,2 sanguin. Elles contribuent à la première ligne de défense contre les agents pathogènes ainsi qu'à l'activation du système immunitaire acquis , et l'initiation d'une réponse inflammatoire systémique 2-4. Pourtant , en particulier des neutrophiles, le type de granulocytes le plus abondant, et monocytes contribuent également de manière significative à la réglementation et à la fin des événements inflammatoires aigus 5. Par conséquent , ces cellules peuvent également jouer un rôle important dans les maladies inflammatoires chroniques comme la polyarthrite rhumatoïde 6,7. En effet, l' asthme, une maladie pulmonaire inflammatoire chronique, est caractérisée par une déficience de l' apoptose des eosinophiles, le deuxième type de granulocytes dans le sang 8. Pourtant, l'apoptose des granulocytes et de leur élimination rapide par les macrophages sont deux étapes essentielles pendant la terminaison cellulairede l' inflammation 11/09.
Dans les cellules immunitaires nommées deux enzymes étroitement liées, à savoir la myéloperoxydase (MPO, neutrophiles et monocytes) et peroxydase éosinophile (EPO, éosinophiles) peut être trouvé 12,13. Ces peroxydases hème sont classiquement liées à la réponse immunitaire humorale comme ils oxydent deux électroniquement (pseudo-) halogénures à l'hypo (pseudo) correspondant acides halous qui sont connus pour leurs propriétés bactéricides 14-16. Dans des conditions physiologiques FTU principalement forme de l' acide hypochloreux (HOCl) et hypothiocyanite (- RCSO) , tandis que l'acide hypobromeux celui- ci et (HOBr) sont formées par l' OEB 17-19. De nouveaux résultats suggèrent que cette (pseudo-) activité halogénation enzymatique peut également contribuer à la régulation des réponses inflammatoires et à la fin des réactions immunitaires 20,21. En effet, la production de HOCl par la MPO et de produits dérivés ont été présentés pour supprimer T à base de cellules réponses immunitaires adaptatives 22-24.
Afin d'obtenir plus d'idées sur le rôle immunologique des leucocytes du système immunitaire inné à des maladies inflammatoires chroniques et de déterminer la contribution du MPO et de l'OEB à cette fonction physiologique, nous avons développé une méthode pour enrichir rapidement les leucocytes à partir de petits échantillons de sang pour une spécifique ultérieure détermination de l'activité de peroxydase halogénation dans ces cellules. Pour érythrocytaire épuisement, nous avons choisi une méthode normalisée, y compris deux étapes ultérieures de lyse hypotonique avec de l'eau distillée, ce qui conduit à un enrichissement leucocytaire rapide à des coûts de matériaux faibles. Pour la détermination subséquente de la FTU halogénant et l' activité EPO et la HOCl- HOBr spécifique colorant aminophényl fluorescéine (CSA) a été utilisée 25-27. Contrairement à l'application de la peroxydase non spécifique des méthodes de coloration 28,29, cette approche permet la détection sélective de l'activité de peroxydase halogénation, ce qui est souvent altérée à infl sévèreammation 30,31.
Protocol
Representative Results
Discussion
Que les neutrophiles sont les plus abondants dans les leucocytes du sang humain l'isolement de cellules peroxydase positives concentre souvent uniquement sur ces cellules et comprend une séparation des neutrophiles à partir d' autres leucocytes par centrifugation sur gradient de densité 38. Pourtant , comme les neutrophiles sont beaucoup moins abondantes dans les échantillons sanguins murins 39 pour les méthodes plus complexes ces dernières doivent être utilisées 40.</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).
Materials
| materials/equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | – |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | – |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g. 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | – |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | – |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450x g |
| Small centrifuge | eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water | |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | – |
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