非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
小さな非コードRNA（のsRNA）の多様性は急速に拡大し、生物学的プロセスにおける役割、遺伝子調節を含む、浮上しているされています。最も興味深いことに、sRNAsはまた、細胞の外で発見されており、安定的にすべての生物学的流体中に存在しています。このように、細胞外sRNAsは、疾患バイオマーカーの新規なクラスを表し、おそらく、細胞シグナル伝達および細胞間通信ネットワークに関与しています。バイオマーカーとしての可能性を評価するために、sRNAsは血漿、尿、および他の体液中で定量することができます。それにもかかわらず、完全に内分泌信号のような細胞外sRNAsの影響を理解するために、キャリアが輸送と細胞や組織は、細胞外のsRNAプールに貢献する生物学的流体（ 例えば、血漿）、でそれらを保護し、細胞や組織ができるされているかを決定することが重要です外のsRNAを受け入れ、利用します。これらの目標を達成するために、細胞外のキャリアの非常に純粋な集団を単離することが重要ですsRNAプロファイリングおよび定量化のため。我々は以前に、リポタンパク質、特に、高密度リポタンパク質（HDL）、細胞およびHDL-miRNAの間の機能的マイクロRNA（miRNAの）の輸送を大幅疾患において変化していることを実証しました。ここでは、詳細高の両方を使用して、miRNAを含むすべてのsRNAs、下流のプロファイリングおよび定量化のための高純度のHDLを得るために、密度勾配超遠心分離（DGUC）と高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）でタンデムHDL分離を利用した新しいプロトコルシーケンシングおよびリアルタイムPCRアプローチ-throughput。このプロトコルは、HDL上のsRNAsの調査のための貴重な情報源となります。
Introduction
細胞外の非コード小型RNA（sRNAs）疾患のバイオマーカーおよび潜在的な治療標的の新しいクラスを表し、おそらく細胞間コミュニケーション1を容易にします 。 sRNAの最も広く研究されているタイプは、長さが約22 NTSであり、長い前駆体型および一次転写産物2から処理されるマイクロRNA（miRNAを）です。 miRNAは、転写後ためにタンパク質翻訳及びmRNA分解2の誘導の抑制を介して遺伝子発現を調節することが実証されています。それにもかかわらず、miRNAはsRNAsの多くの種類のひとつです。 sRNAsは、親のtRNA（tRNAの由来sRNAs、TDR）、小核のRNA（のsRNA由来sRNAs、sndRNA）、小核小体のRNA（のsnoRNA由来sRNAs、snRNAの）、リボソームRNA（rRNAの由来sRNAs、RDRから切断することができるように）、YのRNA（YDR）、およびその他のRNA 1。これらの新規sRNAsのいくつかの例は、miRNAと同様に機能することが報告されています。しかし、生物学的府遺伝子調節における役割は3-6可能性があるが、これらのsRNAsの多くのnctionsは、まだ決定されていません。最も興味深いことに、miRNAおよび他のsRNAsは、唾液、血漿、尿、及び胆汁を含む細胞外液、中に安定に存在しています。外sRNAsは、おそらく、細胞外小胞（EV）、リポタンパク質、および/または細胞外リボ核タンパク質複合体との会合を通じてのRNaseから保護されています。
以前、我々は、リポタンパク質、即ち、高密度リポタンパク質（HDL）、血漿7における搬送miRNAを報告しました。この研究では、HDLは、連続密度勾配超遠心法（DGUC）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル濾過、FPLC）、およびアフィニティークロマトグラフィー（抗アポリポタンパク質AI（アポA-I）免疫沈降を用いて単離しました）7。リアルタイムPCRベースの低密度アレイと個々のmiRNAアッセイの両方を使用して、miRNAレベルは、HDLで定量治癒から単離されましたなたと高コレステロール血症の被験者7。このアプローチを用いて、miRNAをプロファイルし、高純度のHDL製剤における特定のmiRNAを定量することができました。 2011年以来、私たちは、アフィニティークロマトグラフィーは、HDLの純度を高めているが、抗体の飽和が大幅に収量を制限し、コスト高であることができると判断しました。現在、我々のプロトコルは、ダウンストリームRNA単離とのsRNAの定量化のために高品質のHDLサンプルを生成FPLC、続いDGUCの二段階の順次タンデム方式をお勧めします。近年の例えば sRNAsのハイスループットシークエンシング（sRNAseq）、の進歩、miRNAは、および他の非のmiRNAのsRNAクラスの意識向上に、sRNAseqは、現在の最先端のmiRNAおよびのsRNAプロファイリングです。このように、我々のプロトコルは、定量化miRNAおよびsRNAseqを使用して、HDLサンプル上の他のsRNAsをお勧めします。それにもかかわらず、HDLから単離した全RNAは、個々のmiRNAと他のsRNAsを定量またはリアルタイムPCR aを用いsRNAseq結果を検証するために使用することができますpproaches。ここでは、具体的に収集、精製、定量化、データ分析、および高純度のHDL-sRNAsの検証のためのプロトコルについて説明します。
この論文の全体的な目標は、ヒト血漿から分離された高純度のHDLでのsRNA定量化の実現可能性とプロセスを実証することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、非常に純粋なHDLのハイスループットシークエンシングまたはリアルタイムPCRによりmiRNAおよび他のsRNAsを定量化するために設計されています。いずれのアプローチと同様に、特別な配慮を浄化HDLおよびRNAのプロセスの各ステップに与えられ、その後sRNAsを定量化する必要があります。このプロトコルは、プラズマの≥2 mLで始まるプロジェクトのために設計されています。そ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
Referências
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