מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

Summary

פרוטוקול שונה עבור מניפולציה ploidy משתמשת הלם החום להשפיע על דוכן אחד-מחזור ב cytokinesis בעובר המוקדם. פרוטוקול זה מודגם דג הזברה אבל עשוי לחול על מינים אחרים.

Abstract

מניפולציה של ploidy מאפשר טרנספורמציות שימושי, כגון diploids כדי tetraploids, או haploids כדי diploids. בשנתי ה rerio Danio דג הזברה, במיוחד בדור של diploids gynogenetic הומוזיגוטים שימושי בניתוח גנטי משום שהיא מאפשרת את הייצור הישיר של הומוזיגוטים מאם הטרוזיגוטיים יחידה. מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה לשכפול ploidy מבוסס על הדופק חום במהלך מחזור התא הראשון, 2 הלם תרמי (HS2). באמצעות עיכוב של שכפול צנטריול, שיטה זו גורמת דוכן חלוקת התא מדויק במהלך מחזור התא השני. דוכן החלוקה חד מחזור המדויק, מצמיד את שכפול הדנ"א מעושה, תוצאה הוא שכפול הגנום כולו. פרוטוקולים הקשורים בשיטה זו כוללים ביצת אוסף זרע, UV לטיפול זרע, הפריה חוץ גופייה ודופק חום לגרום לעיכוב חלוקת מחזור אחד תאים ושכפולים ploidy. גרסה שונה של פרוטוקול זה יכול להיות מיושמתploidy כדי לגרום לשינויים בעלי חיים אחרים.

Introduction

פרוטוקול זה מאפשר מניפולציה של ploidy עוברי דג הזברה, כגון בדור של diploids gynogenetic הומוזיגוטים מן haploids gynogenetic (איור 1) או לייצור tetraploids. זו מושגת על ידי גרימת עיכוב cytokinesis המתאים מחזור התא אחת בדיוק (איור 2 א, 2 ב). מהעיכוב של מחזור מפתח cytokinesis מושג על ידי טיפול עם הלם חום. הפרוטוקול הסטנדרטי של הלם תרמי (HS) כמו במקור שתיאר Streisinger ועמיתיו מעורבים דופק הטמפרטורה במהלך MPF תקופת 13-15, וכתוצאה מכך דוכן חלוקת התא חד מחזור במהלך מחזור התא הראשון ^1. היעילות של פרוטוקול זה שופרה לאחרונה על ידי סריקת מחזורי התא מוקדם עם חלון זזה זמני של טיפול בהלם חום. סריקה זו מזוהית בשלב מאוחר יותר עבור הלם חום, עדיין בתוך מחזור התא הראשון (22-24 MPF), כי תוצאות שיעור גבוה יותר של embryos עם דוכן חלוקת התא חד מחזור, אשר במקרה זה משפיע על מחזור התא השני ^2. התצפית כי מניפולציות ניסיון במהלך מחזור התא הראשון להפריע חלוקת תא במהלך מחזור התא השני ולגרום DNA תוכן שכפול גם דווחה מיני דגים אחרים ^3,4. אנו מתייחסים פרוטוקול שונה זה כמו חום 2 הלם (HS2 – המונח "2" משקף כי דופק החום מתרחש בנקודת הזמן יאוחר שיטת HS הרגילה, וכי עיכוב המחזור לתאים הנגרמים HS2 מתרחש במהלך מחזור התא השני ). מחקרים אלה הראו כי בסיס מעצר cytokinesis לאחר הלם חום הוא העיכוב של שכפול צנטריול במהלך הדופק החום, אשר משפיע היווצרות ציר ואינדוקצית תלם מחזור התא הבא. תוצאות HS2 בתשואות של עיכוב מחזור התא מתקרבות 100%, ושיעורים עד שכפול ploidy עד 4 פעמים גבוהות יותר מאשר תקן HS ^2.

עוברים מטופלים שנינותחה הלם חום במהלך רכיבה על אופני תא blastomere מפגינים רבים השפעות מזיקות, הדבר המצביע על כך הלם החום משפיע מספר רב של תהליכים הנדרשים תא חלוק ^2. מצד השני, אם הלם החום מוחל לפני תחילת רכיבת תא (פרק הזמן 0-30 MPF), זה משפיע כנראה עולה בקנה אחד עם הפרעה ספציפית עם שכפול צנטריול ואינו נראה להשפיע תהליכים בתא חיוניים אחרים ² . מחקרים אלה הראו כי הזמן לפני התחלת חלוקת blastomere שנראה תקופת התפתחותית מקובלת באמצעות הלם חום ככלי לתמרן ploidy במיוחד באמצעות עיכוב צנטריול. הגורם הבסיסי של הסלקטיביות לכאורה הלם חום על שכפול צנטריול אינו ידוע, אך עשוי להיות קשור שפלה סלקטיבית של substructures centrosome נצפה תחת עומס חום בסוגי תאים מסוימים, כגון לויקוציטים ^5.

סנכרון זמני של דה העובריvelopment מושגת על ידי הפריה חוץ גופית (IVF). השימוש בתרומת זרע מגבר מטופל במהלך תוצאות הפריה בעוברים דיפלואידי שעם HS2 הנגרמת דוכן cytokinesis חד מחזור להפוך tetraploid. השימוש בתרומת זרע מגבר שטופלו UV, אשר נושאת crosslinks כי להשבית DNA, תוצאות בעוברים gynogenetic הפלואידים ^6, שעם HSII הנגרמת דוכן cytokinesis חד מחזור להפוך ² gynogenetic diploids. בגלל שכפול הגנום כולו וכתוצאה מכך, את diploids gynogenetic האחרון הם הומוזיגוטים בכל מוקד יחיד בגנום. לקבלת תמציתיות, אנו מתייחסים gynogenetic עוברים הפלואידים כמו "haploids", ועוברים דיפלואידי gynogenetic הומוזיגוטים כמו "diploids הומוזיגוטים". אם קיימא ופורה, ניתן להשתמש diploids הומוזיגוטים ליזום קווי סטרילי וקטלני חינם. homozygosity ישיר המושרה על ידי HS2 צריך גם לשלב בקלות ניתוח גנטי או מסכי גנטי, מאז diploids הומוזיגוטים מן הנקבות כי הם נשאים הטרוזיגוטיים של mutשיעורי תערוכת ations של homozygosity בבית גבוה וקבוע (50%) יחסים ^2.

הפרוטוקול הבא מתאר צעדים לביצוע HS2 ולגרום שכפול ploidy עם homozygosity מלא. לייצור tetraploid, פתרון הזרע צריך להיות מטופל. לייצור דיפלואידי הומוזיגוטים, הזרע צריך להיות מומת על ידי טיפול UV. בנוסף, כפי שמתואר הדיון, סמני פיגמנט גלויים יכולים לשמש גם כדי להקל על זיהוי של diploids הומוזיגוטים. תאומת דג זברה בעיקר במהלך השעות 3 הראשונות של הייזום של מחזור האור שלהם ^7, ושניהם המבוגרים והביצים רגישות מקצבי יממת ^8, כך להשגת התוצאות הטובות ביותר את תהליך ההזרעה המלאכותי אמור להתרחש בתוך פרק זמן זה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם מאוניברסיטת ויסקונסין – מדיסון טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) הנחיות (אוניברסיטת ויסקונסין – מספר אבטחת מדיסון A3368-01). 1. בחירת נקבות עבור ביצה אוסף באמצעות הזדווגות בהפרעה …

Representative Results

למרות דוכן cytokinesis מחזור חד-תאי, שכפול ה- DNA מתרחש בדרך כלל עובר כאלה, וכתוצאה מכך שכפול של תוכן DNA של העובר (איור 1). פרוטוקול הלם חום Streisinger (HS הרגיל) כרוך דופק חום במהלך הפרית תקופת 13-15 דקות (MPF) ומשרת מעצר cytokinesis בעיקר במהלך חלוקת התא העוברית הראש…

Discussion

צעדים קריטיים

זה קריטי לעבוד בתנאים של יעיל הפריה חוץ גופית. כדי להבטיח אספקה ​​טובה של ביציות בשלות (שלב 1), נקבות להגדיר עבור הזדווגות לא היה צריך להגדיר ב צלבי הזדווגות במשך 5 ימים לפחות, והיא אמורה להופיע הרה. במהלך ההפרעה של רבי?…

Materials

Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO4-7H2O	Sigma	63138
NaHCO3	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml			any maker
Ice bucket			any maker
Pipetteman P-1000			any maker
Pipette tips 1000 µl			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
UV lamp	UVP	Model XX-15 (cat No. UVP18006201)	available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses			any maker
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
Tea strainer			available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
water bath (2)			any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1	see above	see above	8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2	see above	see above	0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 4	see above	see above	0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 5	see above	see above	1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hank's Premix	see above	see above	add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4°C
Hanks’ Solution 6	see above	see above	0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution)	see above	see above	Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)